Abstrakt
syfte. Sarkoidos är en systemisk granulomatös sjukdom med okänd etiologi. Många kliniska presentationer har rapporterats, och akut sjukdom måste särskiljas från subakut och kronisk sjukdom. Den oförutsägbara kliniska förloppet av sjukdomen fick oss att utvärdera den kliniska nyttan av biomarker serumdetektion vid sarkoidos uppföljning. Sätt., Serumkoncentrationer av chitotriosidas, ACE, KL-6 och lysozym analyserades med olika metoder i en population av 74 sarkoidospatienter (46 på steroidbehandling vid provtagning) som regelbundet övervakas vid Siena sarkoidos regionala remiss Center och i en grupp av kontroller i syfte att jämföra deras bidrag till klinisk hantering av sarkoidospatienter. Resultat., KL – 6-koncentrationerna var signifikant förhöjda hos sarkoidospatienter med lungfibros och var signifikant korrelerade med DLco-och KPI-poäng, medan chitotriosidas var signifikant högre hos patienter med extrapulmonell lokaliseringar. Med ett gränsvärde på 303,5 IE/ml visade KL-6 den bästa känsligheten (78%), medan chitotriosidas rapporterade den bästa specificiteten (85%) bland biomarkörerna. Slutsats. KL-6 är en pålitlig biomarkör av fibrotisk lungengagemang hos sarkoidospatienter., Bland biomarkörer visade KL-6 den bästa känsligheten och serum chitotriosidas den bästa specificiteten, även hos patienter med kronisk steroidbehandling, och verkade korrelera med extrapulmonala lokaliseringar.
1. Inledning
sarkoidos är en systemisk granulomatös sjukdom associerad med T-lymfocyt-och makrofagaktivering och migration till drabbade organ. Interaktionen mellan antigener och APC polariserar T-lymfocyter till T helper 1 fenotyp (Th1), vilket leder till bildandet av sarkoida granulom bestående av T-celler, makrofager och epithelioid och jätteceller ., Förloppet av sarkoidos är oförutsägbart: remission sker i de flesta fall, medan persistent granulominflammation kan leda till fibrotisk lungsjukdom . Specifika biomarkörer med god känslighet och specificitet behövs därför för att förutsäga kliniskt utfall och vägleda kliniska beslut.
humant chitotriosidas är en biomarkör som utsöndras av aktiverade makrofager och neutrofiler. Även om dess fysiologiska roll inte är tydlig kan den spela en roll i hydrolysen och nedbrytningen av kitin-och kitinliknande substrat ., Ökade koncentrationer av chitotriosidas har rapporterats i serum och BAL hos patienter med aktiv sarkoidos . Chitotriosidas visar en korrelation med radiologiska steg. Det kan förutsäga klinisk kurs, steroid respons och potentiella återfall av sjukdomen . Det är emellertid inte klart om chitotriosidas är tillförlitligt vid hantering av sarkoidospatienter med extrapulmonell organengagemang.
angiotensinkonverterande enzym (ACE) är ett surt glykoprotein som omvandlar angiotensin I till angiotensin II., Det produceras av lungendoteliala celler, huvudsakligen aktiverade alveolära makrofager . Det är förhöjt i serum och BAL av sarkoidospatienter och dess koncentrationer korrelerar med radiologiska steg . Emellertid är dess användbarhet som ett diagnostiskt och prognostiskt verktyg begränsat av dess låga känslighet och specificitet. ACE kan vara förhöjd i vissa granulomatösa störningar (inklusive berylliosis och silikos), hypertyreoidism, diabetes och andra sjukdomar .
lysozym produceras av monocyt-makrofag-systemet och epithelioida celler som är involverade i granulombildning kan frigöra detta enzym., Sarkoidospatienter visar ökad koncentration av lysozym vid starten. Lysozym betraktas mer som en prognostisk indikator snarare än ett diagnostiskt verktyg. Den har en låg specificitet som förhöjs i lungsjukdomar som tuberkulos och pneumokonios .
Krebs von den Lungen-6 (KL-6) är ett humant högmolekylärt MUC1-mucinprotein som härrör från AEC. Dess serumkoncentrationer är förhöjda i flera ILDs, inklusive idiopatisk lungfibros och sarkoidos ., Vid sarkoidos korrelerar KL-6 med ACE-aktivitet: det ökar huvudsakligen i steg 2 och 3 patienter med scintigrafisk tecken på positiv lungackumulering . Höga nivåer av serum KL-6 i sarkoidos återspeglar produktionen av KL-6 härrörande från skadade eller regenererande typ 2 pneumocyter .
i denna studie jämförde vi serumnivåerna av olika biomarkörer i en kohort av patienter med kronisk sarkoidos efter korrelationer med specifika fenotyper, klinisk presentation och lokaliseringar.
2. Material och metoder
2.1., Studiepopulationen
i efterhand rekryterade vi 74 sarkoidospatienter (27 män (36, 5%), med en medelålder på år) som regelbundet övervakades vid Sienas regionala Remisscentrum för sarkoidos och ILDs. Alla patienter som diagnostiserades enligt internationella ATS/ERS/WASOG kriterier. Alla hade varit i uppföljning i vårt centrum i mer än 2 år sedan diagnosen och visade en ihållande kronisk sjukdom. Uteslutningskriterierna inkluderade patienter med Lofgrens syndrom, akut sjukdomsuppkomst, spontan upplösning eller en uppföljning på mindre än 2 år.,
serumprovtagning utfördes vid inskrivningen: samma dag utfördes lungfunktionstest (PFT) och lungröntgen, med radiologisk iscensättning enligt Scaddkriterier. Den radiologiska klassificeringen var kopplad till provdetektering på ett standard sätt enligt allmänt accepterade kriterier: steg 0, normal; steg 1, bilateral hilar adenopati utan parenkymal inblandning; steg 2, bilateral adenopati och parenkymal infiltration; steg 3, parenkymal infiltration; och steg 4, lungfibros associerad med sarkoidos., Alla patienter genomgick högupplösande CT – skanning av bröstet (HRCT) för att kontrollera lungfibros. Alla ämnen gav sitt informerade samtycke till studien, godkänd av den lokala etiska kommittén. För att hitta ett cut-off-värde av serum KL-6 i vår befolkning samlade vi serumprover från 25 friska frivilliga (6 män, medelålders år), utan historia av andningssjukdomar och inte tar några droger
2.2., Lungfunktionstester
följande lungfunktionsmätningar utfördes enligt ATS / ERS standardparametrar, med användning av en Jaeger Kroppspletysmografi med korrigeringar för temperatur och barometertryck: forcerad expiratorisk volym i första sekunden (FEV1), forcerad vitalkapacitet (FVC) och diffus lungkolmonoxid (DLCO). Alla parametrar uttrycktes som procentandelar av förutsagda värden .
2.3., Klinisk fenotypning
patienter klassificerades på grundval av radiologisk lungpåverkan och sarkoidos lokaliseringar, enligt den senaste genotyp-fenotyp relation i sarkoidos dokument (Genfenresa) , liksom komposit fysiologiskt index (KPI) poäng. Vi beräknade KPI i varje patient enligt följande formel, som tidigare beskrivits: 91 – (predicted DLCO) – (predicted FVC)+.,
Extrapulmonella lokaliseringar av sjukdomen utvärderades med organspecifika diagnostiska vägar: inblandning av lever, mjälte, ben, benmärg, extratorakala lymfkörtlar och hud var alla biopsi bevisade, medan hjärtlokalisering utvärderades med MR-bildbehandling.
2, 4. Chitotriosidas-Test
chitotriosidas-aktivitet bestämdes med en fluorimetrisk metod med 22 µM 4-metylumbelliferyl β-d-n,n,n-triacetylchitotriosidas (Sigma Chemical Co.) i citrat-fosfatbuffert, pH 5,2; 100 µl substrat inkuberades för 1 h vid 37 ° C och reaktionen stoppades med 1,4 ml 0.,1 m glycin-NaOH-Buffert, pH 10,8. Fluorescens lästes vid 450 nm med en PerkinElmer Victor X4 fluorimeter (excitationsvåglängd 365 nm). Serumaktivitet av chitotriosidas uttrycktes i nmol / ml / h. Normalitetsvärden beräknades enligt våra tidigare studier .
2, 5. ACE-analys
ACE-aktivitet mättes med en kolorimetrisk metod (FAR srl, Verona, Italien) för bestämning av ACE-aktivitet i serum. Det normala intervallet av ACE-koncentrationer var 30-80 IE / l .
2.6. Lysozymanalys
2,7., Krebs von den Lungen-6-Analys
Serum KL-6 mättes genom NANOPIA® KL-6 reagenser analys (Sekisui Diagnostik, STORBRITANNIEN). Analysprincipen är agglutination av sialylerat kolhydratantigen i prover med KL-6 monoklonal antikropp genom antigen-antikroppsreaktionen. Förändringen i absorbans mäts för att bestämma serum KL-6 nivåer. KL-6-koncentrationer uttrycks i IE / ml.
2.8. Statistisk analys
uppgifterna uttrycktes som . Jämförelser mellan grupper utfördes av Mann-Whitney test och Kruskal-Wallis test med betydelse inställd på ., Spearman-testet användes för att leta efter korrelationer mellan variabler. Statistisk analys och ROC-kurvor utfördes med Statistica v 7.0, grafiska representationer av data genomfördes med hjälp av GraphPad Prism 4.0 programvara.
3. Resultat
3.1. Kliniska, radiologiska och funktionella parametrar
demografiska egenskaper, lungfunktionstestvärden och Scadding radiologiska stadier av befolkningen rapporteras i Tabell 1. Som förväntat , debuterade främst i den 5: e decennium (år), förhärskande i never-rökare kvinnor., När det gäller medicinsk historia var 46 patienter (62%, 17 män) på steroidbehandling vid tidpunkten för serumprovtagning, med en genomsnittlig dos prednison. Av dessa tog alla utom en orala steroider i mer än ett år. 13 patienter (3 män) tog immunosuppressiva läkemedel i kombination med orala steroider (12 med metotrexat, 1 med azatioprin). Bland steroidfri subgrupp (28 patienter, 10 män) hade endast två patienter aldrig tagit specifik behandling för sarkoidos.,
i vår befolkning var PFT-parametrar i det normala intervallet utan någon signifikant förändring av lungvolymerna: 63 patienter lyckades utföra en acceptabel manöver för DLCO som i genomsnitt var mildt nedsatt.
3.2. Jämförelse av biomarkörer
serum KL-6-koncentration beräknades hos alla patienter och friska frivilliga; ACE och lysozym detekterades i serum hos alla patienter. Sex patienter med chitotriosidasaktivitet <10 nmol/ml/h misstänktes ha CHIT1-polymorfism och uteslöts från analysen.,
inga signifikanta skillnader i biomarkörernas nivåer hittades mellan patienter som behandlades med steroider och de som behandlades med steroider och immunosuppressiv behandling.
KL-6 var signifikant korrelerad med ACE (; ), lysozym (;) och chitotriosidasaktivitet (; ) (Figur 1).,
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Organ Involvement and Phenotypes
The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., De vanligaste extrapulmonala lokaliseringarna var hud (16 patienter, 21, 6%), mjälte (11 patienter, 14, 8%) och lever (5 patienter, 6, 7%). Mindre vanliga lokaliseringar var ögonen (3 patienter, 4% av fallen) och extratorakala lymfkörtlar (3 patienter, 4%); CNS (2 patienter 2,7% av fallen) och hjärt -, ben-eller benmärgsengagemang (1,3% av fallen). Sarkoidospatienter med extrapulmonell inblandning hade signifikant högre chitotriosidasaktivitet än de med begränsad lungsjukdom (;) (Figur 3). Inga andra signifikanta skillnader observerades i förhållande till organlokaliseringar.,
i förhållande till genfenresafenotyper visade patienter med abdominal involvering () signifikant högre chitotriosidasaktivitet än de med okulär-hjärt-kutan-centrala nervsystemet (OCCC) (), muskuloskeletal-kutan () och isolerad pulmonell involvering () (, respektive;)., Inga statistiskt signifikanta skillnader hittades mellan KL-6 -, ACE-och lysozymnivåerna i dessa undergrupper.
enligt radiologisk poäng visade patienter med fibrotisk sarkoidos (stadium 4) de högsta koncentrationerna av serum KL-6 jämfört med de andra radiologiska sjukdomsstadierna () (Figur 4).
4., Diskussion
många biomarkörer har föreslagits för sarkoidos, men ingen har visat tillfredsställande prognostiskt värde för att identifiera återfall under behandling eller vital organlokalisering. I denna studie jämförde vi olika sarkoidosbiomarkörer. Vi valde kroniska sjukdomspatienter i behandling i mer än 1 år med kliniska och demografiska data som är kompatibla med de allmänna egenskaperna hos sarkoidos som rapporterats i litteraturen . Vi inkluderade KL-6 i listan över biomarkörer, även om detta protein har studerats i IPF och små data finns tillgängliga om dess roll i sarkoidos., Vårt intresse för KL-6 var relaterat till dess rapporterade korrelation med svår fibrotisk lungpåverkan och dålig överlevnad . Chitotriosidas, ACE och lysozym visade en lägre prevalens i vår befolkning än tidigare observerat, förmodligen för att de flesta patienter var på långvarig systemisk behandling med steroider och inte visade tecken på aktiv sjukdom vid tidpunkten för serumprovtagning. Tvärtom visade KL-6 en bra känslighet och specificitet i vår befolkning, med ett avskärningsvärde på 303,5 IE/ml., Enligt vår kunskap är detta den första studien för att undersöka ett specifikt avstängningsvärde för KL-6 vid kronisk sarkoidos jämfört med en grupp friska kontroller.detta var dock inte huvudsyftet med studien och data måste valideras i en bredare kohort av patienter. Våra resultat bekräftade det prediktiva värdet av KL-6 för fibrotisk lungengagemang och funktionsnedsättning hos ILD sarkoidospatienter som redan rapporterats av Miyoshi et al., ; vår studie är dock den första som visar en signifikant korrelation mellan en serumbiomarkör, KL-6 och lungfibrotisk lungengagemang hos sarkoidospatienter, kvantifierad av CPI-index. Dessutom bekräftas detta fynd ytterligare av en signifikant korrelation med DLCO-procentsatser, vilket upprätthåller den potentiella nyttan av KL-6-mätningar för att utvärdera sarkoidoss svårighetsgrad vid klinisk behandling av dessa patienter., Dessa data var konsekventa oavsett behandlingsstatus, vilket tyder på en kronisk makrofagaktivering som inte svarade på steroidbehandling, särskilt hos patienter med fibrotisk lungsjukdom. Inga signifikanta skillnader i KL-6-uttryck hittades bland kliniska fenotyper och / eller extrapulmonella lokaliseringar, vilket indikerar att KL-6 endast kan anses vara tillförlitliga för lungengagemang av sjukdom. Positiva korrelationer upptäcktes bland biomarkörer sarkoidos, inklusive ACE, lysozym, chitotriosidas och KL-6, som därför kan ingå i listan över prognostiska indikatorer.,
å andra sidan visade sig chitotriosidas vara känsligare än ACE, lysozym och KL-6 även hos patienter under systemisk behandling; det verkar också vara den enda biomarkören som kan återspegla extratorakalt engagemang, enligt den senaste kliniska fenotypklassificeringen av genfenresa., I synnerhet är dess uttryck mer uttalat hos patienter med bukorganlokaliseringar (lever och mjälte, i vår population), förmodligen på grund av en överexpression av aktiverade inhemska makrofager; dessa data tyder på att chitotriosidas kan vara en pålitlig markör för aktivering av retikuloendotelialt system i sarkoidos, som tidigare rapporterats hos patienter med lysosomal lagringssjukdom . Inga studier finns tillgängliga på chitotriosidas prognostiskt värde i mjälten och lever sarkoidos lokaliseringar och detta är en relevant nyhet i denna studie., Till skillnad från KL-6 verkar chitotriosidasaktiviteten inte korreleras med svårighetsgraden av sarkoid lungengagemang eller funktionsnedsättning, vilket tyder på att olika mönster av makrofagaktivering kan förekomma i andningsorganen hos sarkoidospatienter och påverka biomarkörernas uttryck .
Sammanfattningsvis är patienter med kronisk sarkoidos, svår extrapulmonell inblandning eller stadium 4 fibrotisk försämring ett viktigt mål som kräver identifiering av tillförlitliga prognostiska biomarkörer för att förutsäga sjukdomsåterfall och svar på systemisk behandling.,
baserat på dessa preliminära resultat observerades höga nivåer av chitotriosidas och KL-6 (och inte ACE eller lsysozym) hos kroniska sarkoidospatienter, oavsett behandling. Chitotriosidasaktiviteten var signifikant högre hos patienter med multipel organs engagemang, vilket visade en lovande tillförlitlighet för utvärdering av multisistemisk sarkoidos. Tvärtom föreslår KL-6-nivåer korrelerade med fibrotisk lungpåverkan, KPI-poäng och reducerade DLCO-procentsatser en potentiell roll som en markör för svårighetsgrad av lungarkoidos., Intressant, dessa fynd rapporterades i en population av kroniska multiorgan sarkoidos patienter, inklusive de på terapi, utöka tillförlitligheten av chitotriosidas och KL-6 även i denna inställning.
datatillgänglighet
datauppsättningarna som genereras under och/eller analyseras under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran. Uppgifter finns tillgängliga från Laura Bergantini ([email protected]) och Elena Bargagli ([email protected]) för forskare som inte uppfyller kriterierna för att få tillgång till konfidentiella uppgifter.,
intressekonflikter
författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
författarnas bidrag
Laura Bergantini och Francesco Bianchi bidrog också till studien.
bekräftelse
det nuvarande arbetet utfördes vid Sienas universitet.
Lämna ett svar