PMC (Svenska)

TEXT

Natalizumab, en antikropp som används för att behandla återfallande multipel skleros (MS), förhindrar handel med aktiverade lymfocyter, inklusive autoreaktiva lymfocyter, genom blod-hjärnbarriären (BBB). Den viktigaste negativa effekten av natalizumab är progressiv multifokal leukoencefalopati (PML), en förödande demyeliniserande sjukdom som orsakas av replikering av mänskliga JC polyomavirus (JCV) i oligodendrocyter och astrocyter (1, 2)., Natalizumab hämning av effector t-cellhandel från blod till centrala nervsystemet (CNS) kan gynna lokal JCV-replikation (3-7).

här undersökte vi närvaron av JCV-specifika effektorminne T-celler (TEM) i blod hos MS-patienter efter aktivering av antigen ex vivo över natten. In vivo minskar specifika TEM-nummer när cognatantigen rensas (8-10), och deras närvaro kan därmed peka på pågående JCV-replikation. Tem frisätter snabbt cytokiner såsom gammainterferon (IFN-γ) när de återexponeras till antigen., En tidigare enzymbunden immunosorbentpunktsanalys (ELISPOT) undersökte IFN-γ-uttryck i T-celler efter långvarig aktivering med JCV-peptider i upp till 14 dagar (11). Långvarig aktivering gör det dock möjligt att återaktivera och utöka det tysta t-cellminnet, vilket innebär att ett positivt svar inte nödvändigtvis innebär ett pågående immunsvar. Här undersökte vi först förekomsten av JCV-specifik TEM hos två MS-patienter som utvecklade PML. Den första patienten diagnostiserades med PML efter 39 månader på natalizumab (39 infusioner) (Institutionen för neurologi, Pitié-Salpétrière sjukhus)., Hon var 39 år gammal och hade en 10-årig historia av återfallande remitterande MS. före natalizumab hade hon fått cyklofosfamid och mitoxantron. PML bekräftades av MRI och JCV PCR på cerebrospinalvätska (CSF). När hon testades för JCV-specifik TEM, 8 veckor efter PML-symtomdebut, hade hon 1 040 JCV genomkopior per ml CSF (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Hennes perifera mononukleära celler (PBMC) aktiverades in vitro i MÅL-V och Albumax medium (Invitrogen) för 16 h med renat JCV (stam MAD-4; LGC Promochem; 104.5 50% mjukpapper kultur smittsam dos /0,2 ml)., Ingen rekombinant interleukin 2 (IL-2) tillsattes. En mängd virus som motsvarar 5.534 PFU tillsattes till varje brunn. Detta motsvarade en mångfald av infektion (MOI) av 0,02. Celler testades sedan för intracellulär IFN-γ genom flödescytometri. Celldödligheten efter aktivering över natten var mindre än 5%. Som visas i Fig. 1A och andB,B, svara celler har påvisats i både CD4 och CD8 T-cell undergrupper, och de flesta av dem hade CCR7− CD45RA− fenotyp egenskap av minne effectors (12)., Anti – JCV TEM detekterades också av IFN-γ ELISPOT (fånga och detektera antikroppar, kloner 1-D1 och K7-B6-1, respektive; Mabtech) efter 16 h av aktivering med renade JCV eller VP-1 peptider (en blandning av 14 pooler av överlappande 15-aminosyrapeptider som täcker hela JCV VP-1-proteinet) (Fig. 1C). Den andra patienten var 46 år gammal och hade en 11-årig historia av återfallande remitterande MS. före natalizumab hade hon fått betainterferon, glatirameracetat, azatioprin och mitoxantron. Hon remitterades till Tenon Hospital MS center för omvärdering efter 24 natalizumab infusioner., En hjärnmri som utfördes i maj 2012 upptäckte en liten, linjär, T2-hyperintense misstänkt lesion i den juxtakortiska högra frontalregionen. Det första GSR-provet var negativt för JCV. Upprepa MRI efter natalizumab tillbakadragande avslöjade en ökning av lesion storlek, vilket ledde till två ytterligare CSF undersökningar, som båda var negativa för JCV. JCV PCR på plasma-utfördes 2 och 4 månader efter debuten av PML. Båda plasmaproverna var negativa. Hjärnbiopsi utförd i September 2012 bekräftade slutligen diagnosen PML.,

ELISPOT-analys av IFN-γ-svaret på JCV, utförd 2 dagar efter den sista natalizumab-infusionen, visade närvaron av JCV-specifik TEM i blod (Fig. 1C). Intressant var cirkulerande JCV-specifika TEM-nummer lägre än i den första PML-patienten, som kan ha haft en högre nivå av JCV-replikering i hjärnan, eftersom JCV PCR på CSF var positiv i den första patienten och negativ i den andra.,

vi undersökte också närvaron av JCV-specifik TEM av ELISPOT i en serie av 62 MS-patienter med återfallande remitterande MS som behandlades med natalizumab enligt de europeiska marknadsvillkoren, liksom hos 35 MS-patienter som inte fick någon sjukdomsmodifierande behandling och en grupp av 40 friska givare matchade för ålder och kön med MS-patienter. Ms-patienternas egenskaper visas i Tabell 1. Patienterna och friska donatorer gav sitt skriftliga samtycke till att delta i studien, som godkändes av etikkommittén för Pitié-Salpêtrière Hospital, Paris., Ett ELISPOT-svar ansågs positivt om det korrigerade antalet fläckar (antalet fläckar i aktiverade brunnar minus antalet fläckar i obehandlade brunnar) var minst 10, med färre än 10 fläckar i obehandlade brunnar.

andelen positiva prover var 2,5% hos friska donatorer (Fig. 2A). I MS-gruppen ökade andelen positiva patienter med tiden på natalizumab (Fig. Från 8, 8% hos obehandlade MS-patienter till 15, 9% bland patienter som behandlats med natalizumab i mindre än 24 månader och 27% bland patienter som behandlats i mer än 24 månader (Fig., 2C) (signifikant för patienter som behandlats i mer än 24 månader jämfört med obehandlade MS och jämfört med kontrollpersoner). Denna ökning av detekteringsfrekvensen för JCV TEM-svar tyder på att långvarig natalizumab-behandling gynnade JCV-reaktivering.

en delmängd av natalizumabbehandlade patienter samplades minst två gånger (Se tabell 1). Som visas i Fig. 2D, de flesta av dessa patienter antingen blev eller förblev positiva under provtagningsperioden.,

njuren är en viktig reservoar för JCV. En betydande andel av den allmänna befolkningen utsöndrar viruset i urinen men har inga tecken på JCV i blodet (13-15). Dessutom verkar närvaron av JCV-DNA i hjärnan vara oberoende av dess närvaro i njuren (16). Som visas i Fig. 60% av MS-patienter med detekterbar JCV TEM i blodet hade ingen detekterbar JCV i urinen, och 69% av patienterna med positiv JCV PCR i urinen hade ingen detekterbar JCV TEM. JCV urinutsöndring utan detekterbar JCV TEM observerades också hos friska donatorer (Fig. 2E)., Detta tyder på att närvaron av JCV-replikation i njuren inte nödvändigtvis leder till detekterbar JCV TEM i blodet. Omvänt ökar detta möjligheten att JCV TEM-detektion i blod kan återspegla pågående extrarenal JCV-replikation.

i en studie med användning av en ny JCV enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA)-metod (17) var den uppskattade seroprevalensen av JCV hos MS-patienter som behandlades med natalizumab 53, 6% (17). Seropositivitet korrelerar inte nödvändigtvis med förekomsten av TEM-svar, vilket är relaterat till virusreaktivering., Långlivade plasmaceller kan kvarstå i benmärgen under långa tidsperioder, kanske i årtionden, upprätthålla ihållande serum antikroppstitrar utan aktiv patogen replikation (18, 19). Vi använder samma metod ELISA för att testa 56 av våra natalizumab-behandlade MS-patienter som hade testats av JCV ELISPOT, inklusive 2 PML patienter. Som visas i Fig. 2F, 53, 6% av patienterna var seropositiva och 16, 1% var ELISPOT-positiva. 27 procent av JCV-seropositiva patienter hade detekterbara JCV TEM i blodet. Endast en patient som var JCV ELISPOT positiv var seronegativ., Enligt Gorelik et al. är den falskt negativa frekvensen av JCV-serologiska analysen 2,5% (17).

våra resultat visar att frekvensen för detektering av JCV TEM-svar hos MS-patienter ökar med tiden på natalizumab. En tidigare studie visade också en ökning av T-cellsvaret på JCV efter 12 månaders natalizumabbehandling, men denna studie var begränsad till 18 månaders behandling (20), medan vi fann att den starkaste ökningen av effector T-cellsvar inträffade efter 24 månader.,

våra resultat pekar således på JCV-reaktivering under natalizumab-terapi, inklusive i extrarenal platser. JCV har detekterats i hjärnan hos HIV-seronegativa individer utan PML (21). Den minskade CNS-immunosövervakningen inducerad av natalizumab kan gynna lokal virusreaktivering som kan börja som asymptomatisk intermittent virusreplikation men kan utvecklas mot fortsatt virusreplikation och sedan till PML. Virusreaktivering kan aktivera perifera specifika T-lymfocyter, via antigenpresenterande celler, på platser som hjärndränerande cervikala lymfkörtlar (22-24)., Eftersom natalizumab riktar sig mot vla-4-receptorn, kan dessa specifika celler inte effektivt korsa blod-hjärnbarriären och kan därmed ackumuleras i blod, vilket underlättar deras upptäckt. PML är också en komplikation av sen stadium HIV-infektion. Huruvida detektering av JCV-specifika effektor CD4-och CD8-T-celler kan föregå AIDS-associerad PML är en intressant punkt som förtjänar ytterligare undersökning. AIDS-associerad PML skiljer sig emellertid tydligt från natalizumab-inducerad PML., De flesta HIV-infekterade patienter som utvecklar PML har djup CD4 lymfopeni, vilket också förändrar CD8 T-cellens funktionalitet genom bristen på CD4-hjälp (25). Dessutom finns det, till skillnad från patienter på natalizumab, ingen blockad av T-cellhandel genom blod-hjärnbarriären, och detta kan förhindra JCV-specifik tem-ackumulering i blod.

tillsammans tyder våra resultat på att funktionella analyser som kan upptäcka JCV-specifika TEM-svar kan bidra till att identifiera patienter som riskerar att utveckla PML under behandling med antikroppar som hämmar lymfocythandel genom blod-hjärnbarriären.,