En nybörjares Guide till att Nästa Generations Sekvensering (NGS) Teknik

slutförandet av the Human Genome Project 2003 inleddes en ny era av snabb, prisvärd och noggrann genomet analys—som kallas Nästa Generations Sekvensering (NGS). NGS bygger på ”första generationens sekvensering” – teknik för att ge exakta och kostnadseffektiva sekvenseringsresultat.

Fred Sanger sekvenserade det första hela DNA-genomet, virusfagen ?X174, 1977., Samma år utvecklade Sanger den framtida ryggraden i genomtiden: DNA-sekvenseringsteknik. Hans teknik använde kedjans termineringsmetod. Detta ses nu som ”första generationens teknik” av genomsekvensering.

eftersom Sanger-sekvensering (eller kedjetermineringsmetoden) är den första generationen sekvenseringsteknik, är det mycket viktigt att förstå det. Det mänskliga genomet projektet började med Sanger sekvenseringsteknik.,

Sanger-sekvenseringsmetoden

Sanger-sekvenseringsmetoden bygger på dideoxynucleotider (ddNTPs),en typ av deoxynucleosidtrifosfater (dNTPs), som saknar en 3′ hydroxylgrupp och har en väteatom istället . När dessa baser binder till den växande DNA-sekvensen avslutar de replikering eftersom de inte kan binda andra baser. För att utföra Sanger-sekvensering lägger du till dina primers till en lösning som innehåller den genetiska informationen som ska sekvenseras och delar sedan upp lösningen i fyra PCR-reaktioner., Varje reaktion innehåller en med dNTP mix med en av de fyra kvävebaserna ersättas med en ddNTP (A, T, G och C ddNTP grupper). I slutet av PCR kommer var och en av dina fyra reaktioner att ge PCR-produkter av olika längder eftersom replikering slumpmässigt avslutas. Genom att köra proverna på en gel med 4 körfält kan du dela ihop sekvensen eftersom varje sekvens har replikerats från samma ursprungliga material. Här är ett exempel där ddntps är i fetstil och dNTPs är inte:

din sekvens är ATGCTCAG.,

Dina fyra reaktioner ger dig:
en Reaktion med ddATP: A, ATGCTCA, ATGCTCAG
en Reaktion med ddGTP: ATG, ATGCTCAG
en Reaktion med ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
en Reaktion med ddTTP: AT, ATGCT, ATGCTCAG

Alla reaktioner när kör en gel som skulle se ut ungefär så här (Bilden genom att Olwen Reina):

Varje band betecknar olika längder kod. Till exempel är bandet rätt under ”a” symboliserar sekvensen: ”ATGCTCA”

fortfarande förvirrad?

låt oss föreställa oss ett partispel. Spelet är en gissningslek., Så här spelas det:

du tänker på ett nummer och gruppen måste gissa det. Den knepiga delen är att numret är 200-siffror i längd. Du läser siffrorna i numret i ditt huvud utan att göra ett ljud. Varje så ofta avbryter en person dig, och du berättar för dem den enda siffran du bara tänkte och var den är i sekvensen av 200. Varje gång du avbryts måste du börja om. Du går efter några timmar och gruppen måste räkna ut det 200-siffriga numret., De måste pussla ihop den information du gav dem, till exempel 25: e numret var 5, 40: e numret var 0, och så vidare. Med hjälp av informationen från deras avbrott kan de upprepa numret de gav dig.

Även om detta låter som den lamest spelet i världen, det fungerar mycket bra för sekvensering!

tyvärr är det långsamt, dyrt och (tidigare) förlitar sig på radioaktiva material. Detta drev forskare att utveckla nya och bättre former av genomsekvensering.,

nästa generations sekvenseringsteknik

de största framstegen inom genomsekvensering har ökat hastighet och noggrannhet, vilket resulterar i minskad arbetskraft och kostnad. Hastigheten är tack vare parallell analys och hög genomströmningsteknik. Det är skillnaden mellan att få en 4-åring att läsa Moby Dick och ge ett stycke vardera till en massa Drama majors och be dem att läsa på en gång.

Sekvenseringsmaskiner har förbättrats vildt sedan Sanger utvecklade sin metod., I 1987 blev Applied Biosystems den första som introducerade en automatisk sekvenseringsmaskin, kallad AB370. Maskinen förlitade sig på en metod som kallas kapillärelektrofores som använde Sanger kedja avslutande metod utan att behöva en gel.

Fluorescentmärkta kedjeavslutande ddNTPs läggs till i PCR-reaktionsmixen. Genom Sanger-sekvenseringsmetoden skapas PCR-produkter av olika längder och separeras sedan enligt deras storlek. Storleken mäts av PCR-produktens totala negativa laddning. Ju mer negativ laddningen desto längre fragment., Ta ovanstående exempel på ddNTP-införlivande och föreställ dig att de djärva bokstäverna är ddNTPs med en fluorokrom bifogad. När fragmenten dras mot den positiva elektroden hos en kapillär (se bilden nedan) passerar de en laserstråle som utlöser en blixt av ljus från fluorokrom fäst vid ddNTP som är karakteristisk för bastypen (till exempel grön för a, gul för T, blå för G, röd för C). På detta sätt läses genomet noggrant.

den största skillnaden här var hastighet och kostnad., AB370 kunde upptäcka 96 baser på en gång, 500K baser per dag, och hade en läslängd på 600 baser med hjälp av en parallell analys och hög genomströmning setup. Denna form av sekvensering blev det viktigaste verktyget för slutförandet av det mänskliga genomprojektet.

Hur jämför NGS med första generationens sekvensering?

NGS kännetecknas av förbättrad noggrannhet och hastighet, men också minskad arbetskraft och kostnad. Det har aldrig funnits en tid där det har varit så billigt, bekvämt eller enkelt att sekvensera ett genom., Förmodligen har den största förbättringen varit utvecklingen av parallellanalys, vilket ökade sekvenseringshastigheten.

det enda som saktar ner oss nu är tolkningen av resultaten!