Abstrakt
Trichomonas vaginalis, en flagellat protozoan, är det orsakande medlet av trichomonos, den vanligaste icke-virus sexuellt överförbara sjukdomen över hela världen. Med tanke på den ökade förekomsten av metronidazolresistenta isolat är alternativa läkemedel avgörande för framgångsrik behandling. Naturliga produkter är källan till de flesta nya droger, och populär visdom om användningen av medicinska växter är ett kraftfullt verktyg i denna sökning., I denna studie utvärderades aktiviteten hos 10 medicinska växter som i stor utsträckning användes i det dagliga livet av mbyá-Guarani indigenous group mot sju olika T. vaginalis-isolat. Bland de vattenhaltiga extrakten testade, Verbena sp. (Guachu ka ’ a i Mbyá-Guarani språk) och Campomanesia xanthocarpa (Guavira i Mbyá-Guarani språk) visade den högsta aktiviteten mot T. vaginalis med MIC-värde på 4,0 mg/mL nå 100% effekt mot parasiten. De kinetiska tillväxtanalyserna visade att extrakten främjade fullständig tillväxtavveckling efter 4 h inkubation., Dessutom främjade de testade extrakten inte en signifikant hemolytisk aktivitet mot mänskliga erytrocyter. Våra resultat visar för första gången den potentiella aktiviteten hos Verbena sp. och C. xanthocarpa mot T. vaginalis. Dessutom visar denna studie att inhemsk kunskap är en viktig källa till nya prototyper av antiprotozoala medel.
1. Inledning
Trichomonas vaginalis parasiterar det urogenitala mänskliga området som orsakar trichomonos, den vanligaste icke-virala sexuellt överförbara sjukdomen över hela världen, som ansvarar för 248 miljoner nya fall årligen ., Efter kolonisering orsakar parasiten vaginit, uretrit och prostatit . Dessutom har patogenen förknippats med allvarliga konsekvenser som negativa graviditetsutfall och för tidig födsel , infertilitet , predisposition till livmoderhalscancer och bäckeninflammatorisk sjukdom . Viktigt är att trichomonos fungerar som en kofaktor i överföring och förvärv av humant immunbristvirus (HIV). Trots effekterna av denna infektion begränsar den terapeutiska Arsenalen, och endast metronidazol och tinidazol, både 5-nitroimidazoldroger, godkänns av FDA för trichomonosbehandling ., Även om härdningshastigheten är hög kan behandlingssvikt observeras och resistansen hos T. vaginalis-isolat är den främsta orsaken till behandlingssvikt . I denna mening är det utan tvekan nödvändigt att undersökningen av nya alternativ för behandling av trikomonos och två strategier kan följas: (i) sökandet efter nya terapeutiska mål, vilket är avgörande för en rationell utveckling av nya antiparasitiska medel och (ii) undersökningen av nya anti-T., vaginalis föreningar strukturellt skiljer sig från 5-nitroimidazoler och följaktligen verkar genom olika mekanism som framgår av vår grupp .
i detta sammanhang är naturliga produkter, särskilt medicinska växter, omätbara som en potent källa till bioaktiva molekyler. Sedan antiken använder människor växter för att behandla vanliga infektionssjukdomar, och några av dessa traditionella läkemedel är fortfarande integrerade som en del av botningen av olika patologier . Dessutom räddar sökningen baserad på etnofarmakologisk information den enorma empiriska kunskapen om växtutnyttjande ., I detta sammanhang är Brasilien ett land av stort intresse för etnofarmakologi när det gäller naturmiljö och stora mängder genetiska resurser .
ursprungsbefolkningen har en mängd information om biologisk mångfald och vet hur man fångar och använder naturresurser . Trots det faktum att flera droger har upptäckts genom traditionella botemedel och folkkunskaper finns i Brasilien 122 inhemska etniska grupper, men endast 30% av dem undersöktes med avseende på etnobotanska aspekter ., Därför är studien av växter som används av inhemsk medicin viktigt att koppla ihop traditionell medicin och biotisk miljö som bevarar den inhemska gamla kunskapen.
parasitiska protozoer är fortfarande ett stort hot mot människors och djurs hälsa, och det finns få effektiva läkemedel för behandling av många protozoer. Med hänsyn till den inhemska etnofarmakologin som bidragsgivare till den systematiska screeningen av växter med antiprotozoal aktivitet utvärderade denna studie anti-T., vaginalis aktivitet av de viktigaste medicinalväxter som används i mbyá-Guarani inhemska medicin ligger i södra Brasilien.
2. Material och metoder
2.1. Parasitkulturförhållanden
i denna studie, sju isolat av T., vaginalis användes: 30236 och 30238 från American Type Culture Collection (ATCC), TV-LACM1, TV-LACM2, och TV-LACM3 (färska kliniska isolat från kvinnliga patienter); TV-LACH1 och TV-LACH2 (färska kliniska isolat från manliga patienter) alla från Laboratório de Análises tunnelbanestationerna clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brasilien (projekt med etiskt godkännande av UFRGS Etisk Forskning, antalet 18923). Trichomonads odlades axeniskt i trypticasjästextrakt-maltos (TYM) medium (pH 6.0), kompletterat med 10% värmeinaktiverat bovint serum och inkuberades vid 37°C .
2.2., Växtmaterial
växtmaterial som samlas in från inhemska stam Mbyá-Guarani ligger vid Lomba göra Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brasilien (30°06’47.62″ S och 51°07’37.85″ W) i Mars 2011. Denna By är denominerad Tekoá Anhetenguá (på engelska, True Village), och 200 personer bor i området samlades vid 40 familjer. Kvinnorna i byn har kunskap om medicinska växter som används av hela befolkningen och genomförde samlingen av exemplar. Tio växter som rutinmässigt används i inhemsk medicin för infektionssjukdomar samlades in: löv av Aloe arborescens Mill., (ICN 173371), ovanjordiska delar av Bidens pilosa L. (ICN 167397), ovanjordiska delar av Rhipsalis baccifera (ICN 167402), bark av Luehea divaricata (ICN 167403), rötter Trichilia sp. (ICN 173126), blad av Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), blad av Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), blad av Citrus limonium (ICN 167399), blad av Citrus reticulata (ICN 173127), och blad av Verbena sp. (ICN 167394). Kupongproverna deponerades på herbarium av Universidade Federal do Rio Grande Do Sul (ICN).
2.3., Beredning av växtextrakt
de färska växtextrakten framställdes i överensstämmelse med traditionell användning av ursprungsbefolkningen genom avkok vid 60°C under 60 min . Vattenhaltiga extrakt frystorkades och arbetslösningen framställdes vid 8.0 mg / mL i ultrapure vatten, steriliserades genom filtrering (0.22 µm) och lagrades vid -20°C.
2.4. Anti-Trichomonas vaginalis-Test
tio vattenextrakt screenades in vitro för aktivitet mot T. vaginalis. Analysen utfördes i 96 mikrotiterplattor vid slutlig koncentration av 4,0 mg / mL i brunnarna., Den hämmande minimikoncentrationen (MIC) bestämdes med en åttafaldig utspädning (4,0–0,031 mg/mL), och trofozoiternas viabilitet bestämdes enligt en fluorimetrisk metod . Två kontroller utfördes: negativ kontroll endast med trofozoiter och en positiv kontroll med 8,0 µM metronidazol (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA). Experimenten utfördes åtminstone i tre oberoende experiment, i tre exemplar. Resultaten uttrycktes som procentandel av viabla trofozoiter jämfört med obehandlade parasiter.
2, 5., För att undersöka effekten av de aktiva vattenhaltiga extrakten på T. vaginalis-tillväxten utfördes en kinetisk tillväxtkurva med hjälp av ATCC 30236-isolatet. Parasiterna initial densitet av 2.0 × 105 trofozoiter / mL inkuberades med extrakten vid MIC värde i TYM medium. Trofozoiterna räknades med en hemocytometer under 72 h. resultaten uttrycktes som trofozoittal (105/mL)., För mikroskopisk analys centrifugerades kontrollerna och behandlade parasiterna i 10 min vid 2 000 rpm för att koncentrera organismerna efter 4 h inkubation och preparatet observerades i lättmikroskop (förstorat ×1 000) genom trypanblå färgämnesuteslutning.
2.6. Hemolytisk analys
denna analys utfördes enligt den metod som användes av Rocha et al. . Blodgrupp O positiv från friska mänskliga volontärer samlades med Alsevers lösning (1 : 1) och centrifugerades vid 2,000 rpm för 5 min. Erytrocytfraktionen tvättades tre gånger med PBS 1x (pH 7.,0) och resuspenderas för att ge 1% röda blodkroppar suspension (v/v). Koncentrationer av vattenextrakt valdes enligt den minsta hämmande koncentration (MIC) som bestämdes i känslighetsanalysen. Erytrocyterna inkuberades med extrakten vid 37 ° C under agitation för 1 h och centrifugerades sedan vid 3000 rpm för 5 min. Supernatantens absorbans mättes vid 540 nm. Experimentet utfördes i tre exemplar, och procentandelen hemolys orsakad av varje prov som testades beräknades i jämförelse med 100% hemolytisk aktivitet av saponin från Quillaja saponaria .
3., Resultat och diskussion
denna studie utvärderade Anti-T. vaginalis-aktiviteten hos vattenhaltiga extrakt av 10 medicinalväxter som används i medicinsystemet Mbyá-Guarani. Viktigt, bland de testade växterna hittade vi två vattenhaltiga extrakt med en potent anti-T. vaginalis in vitro-aktivitet. De lovande extrakten är av Verbena sp. och Campomanesia xanthocarpa. Extraktet från Verbena sp., vid 4, 0 mg / mL, visade den optimala Anti-T. vaginalis-aktiviteten som inducerar fullständig cytotoxicitet (100% av parasiternas död) på alla distinkta trichomonads isolat(Figur 1 (A))., Bladen extrakt av Campomanesia xanthocarpa på samma koncentration visade också en mycket hög anti-T. vaginalis aktivitet, minska parasit bärkraft upp till 96% (Figur 1(b)).
andra vattenhaltiga extrakt visade en mängd olika resultat. Det vattenhaltiga extraktet från Bidens pilosa avskaffade helt trofozoiternas lönsamhet endast för 30236-isolatet(Figur 1 c). Extraktet av barks av Luehea divaricata inducerade en minskning av T. vaginalis viabilitet olika i varje trichomonads isolat testas(Figur 1 (D))., Bladen av Coix lacryma-jobi inducerade i genomsnitt 75% av lönsamhetsminskningen på T. vaginalis-isolaten. för TV-LACH2-isolatet var minskningen dock endast 40% (Figur 1 e). De färska kliniska isolaten från manliga patienter (TV-LACH1 och TV-LACH2) presenterade högre mottaglighet än isolaten från kvinnliga patienter (ATCC och fresh clinical) när rotextraktet av Trichilia sp. testades (Figur 1 f). Extrakt av blad från Citrus limonium minskade ca 40% isolatens viabilitet(Figur 1 (g))., Extrakt från Aloe arborescens och Citrus reticulata minskade lönsamheten för 50% av minst ett isolat (Figur 1(h) och 1(i), medan Rhipsalis baccifera minskas endast 30% lönsamhet 30236 och TV-LACM2 isolat (Figur 1(j)).
i jämförelse med de andra extrakten, extrakten från Verbena sp. och C. xanthocarpa visade den mest lovande aktiviteten mot T. vaginalis, och den minsta hämmande koncentrationen bestämdes för 30236-isolatet (Tabell 1).,
|
|||||||||||||||||||||
för att undersöka effekten av det mest aktiva extraktet på parasitens tillväxt och livskraft utfördes en kinetisk tillväxtkurva. Kontrollen uppvisade den klassiska tillväxttoppen efter 24 timmar av inkubation; de organismer som behandlades med extrakt av Verbena sp. och C., xanthocarpa, efter 4 h av inkubation, framkallade en fullständig tillväxt avskaffande (Figur 2) och visade en karakteristisk blå färg genom trypan blå färgämne uteslutning indikerar celldöd (Figur 3).
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(C) Campomanesia xanthocarpa
mikroskopisk analys av parasiter morfologi i ljusmikroskop (förstorad ×1000) genom trypan blue dye exclusion. a) kontroll, b) efter 4 timmars behandling med vattenhaltigt extrakt av Verbena sp., C) efter 4 timmars behandling med vattenhaltigt extrakt av Campomanesia xanthocarpa.
för att undersöka en möjlig effekt av C. xanthocarpa och Verbena sp., extrakt på parasiter membran och även att ha preliminära uppgifter om cytotoxicitet mot däggdjursceller, hemolytisk aktivitet av dessa extrakt genomfördes. Verbena sp. och C. xanthocarpa-extrakt testades vid MIC-värden och demonstrerade 6.5 respektive 7.6% erytrocytlys (Tabell 1). Dessa resultat visade att båda extrakten, vid MIC-värden, inte främjar en signifikant hemolytisk aktivitet, vilket indikerar att verkningsmekanismen som är ansvarig för parasitens viabilitetsreduktion förmodligen inte innebär parasitisk membranstörning., Dessutom och viktigare, dessa fynd tyder på att båda extrakten inte är giftiga för däggdjursceller, eftersom de inte lysade mänskliga erytrocyter.
denna studie bidrar till att rädda den inhemska kunskapen om medicinska växter. Den inhemska Mbyá-Guarani använda Verbena sp. (Guachu ka ’ a i mbyá-Guarani språk), som te, för lindring av symptom på infektionssjukdomar, såsom feber. Detta är i överenskommelse med den litteratur som rör Verbena sp. infusion som lugnande medel, smärtstillande mot inflammatoriska störningar, hudbrännskador, amenorré, depression och magsjukdomar ., Dessutom har denna art en mängd olika kemiska beståndsdelar, som flavonoid, iridoidglykosider, fenylpropanoidglykosid, steroler, triterpener och glykonjugat, och den biologiska aktiviteten kan delvis tillskrivas dem . Dessutom använder denna stam bladen av C. xanthocarpa (Guavira i mbyá-Guarani språk) för behandling av diarré, magont och maskar., Denna växt som traditionellt används i södra Brasilien som depurative, antidiarrhoeic, cleanser, och antireumatiska medel, och för att minska kolesterol i blodet , och dessa egenskaper kan hänföras till garvämnen, saponiner, och flavonoider (quercetin, myricetin, quercitrin och rutin), föreningar som finns i bladen av C. xanthocarpa .
räddnings etnofarmakologi av historiska användningar av växter är erkänd som värdefull för bioprospektion, eftersom de har råd med motiveringen för urval och forskning av medicinska växter ., Denna studie beskriver den första rapporten om Verbena sp: s antiprotozoala aktivitet. och C. xanthocarpa. Dessutom testades andra arter av familjerna Verbenaceae och Myrtaceae mot T. vaginalis, dock utan framgång . Flera biodiversiteter och traditionell kunskap om olika populationer har väglett studier för att söka nya prototyper anti-T. vaginalis. Nyligen rapporterades potentialen hos växter som traditionellt användes från Caatinga mot T. vaginalis . Calzada et al., visade att växter som används för urogenitala störningar i mexikansk traditionell medicin visade effekt mot denna protozo. Amaryllidaceae arter som används mot venerala sjukdomar i Sydafrika visade också lovande aktivitet mot T. vaginalis .
med tanke på effekterna av trichomonos i folkhälsan och det framväxande antalet resistenta T. vaginalis-isolat är det nödvändigt alternativ för behandling av denna infektion. Naturliga produkter är en lovande källa till aktiva molekyler, och etnofarmakologin räddar kunskapen om befolkningen av medicinska växter., Denna visdom i kombination med kemiska och farmakologiska studier presenterar ett värdefullt värde i bioprospektionen av innovates, säkra och tillgängliga droger. Denna pionjärstudie visade relevanta resultat om Verbena sp: s anti-T. vaginalis-aktivitet. och C. xanthocarpa, växter som traditionellt används av ursprungsbefolkningen Mbyá-Guarani för infektionssjukdomar. Trots att visa stark anti-T. vaginalis-aktivitet räddade denna rapport kunskapen om ursprungsbefolkningen och undviker missfallet av denna visdom.,
författarnas bidrag
Clara Lia Costa Brandelli och Patrícia de Brum Vieira bidrog lika till detta arbete.
bekräftelser
detta arbete stöddes av NANOBIOTEC-Brazil-programmet från CAPES och FAPERGS. Författarna tackar hövdingen José Cirilo Pires Morinico (stam mbyá-Guarani), för att möjliggöra genomförandet av denna studie och för värdefull information. Alexandre José Macedo och Tiana Tasca tacka CNPq för forskare stipendier.
Lämna ett svar