inlärningsmål

  • Recall dideoxynucleotide sequencing

Sanger sequencing, även känd som chain-termination sequencing, hänvisar till en metod för DNA-sekvensering som utvecklats av Frederick Sanger 1977. Denna metod är baserad på förstärkning av DNA – fragmentet som ska sekvenseras av DNA-polymeras och inkorporering av modifierade nukleotider-specifikt dideoxynucleotider (ddNTPs).,

den klassiska kedjetermineringsmetoden kräver en enkelsträngad DNA-mall, en DNA-primer, ett DNA-polymeras, normala deoxynucleotidetrifosfater (dNTPs) och modifierade nukleotider (dideoxyNTPs) som avslutar DNA-strängförlängningen. Dessa kedjeterminerande nukleotider saknar en 3 ’ – OH-grupp som krävs för bildandet av en fosfodiesterbindning mellan två nukleotider, vilket gör att DNA-polymeras upphör med förlängning av DNA när en ddNTP införlivas. DdNTPs kan vara radioaktivt eller fluorescent märkt för detektering i automatiserade sekvenseringsmaskiner.,DNA-provet är uppdelat i fyra separata sekvenseringsreaktioner, innehållande alla fyra av standarddeoxinukleotiderna (dATP, dgtp, dctp och dTTP) och DNA-polymerasen. Till varje reaktion är till endast en av de fyra dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, eller ddTTP). Efter rundor av mall DNA förlängning från den bundna primer, de resulterande DNA-fragmenten värme denatureras och separeras av storlek med hjälp av gel elektrofores. Detta utförs ofta med hjälp av en denaturerande polyakrylamid-urea gel med var och en av de fyra reaktionerna som löper i en av fyra enskilda körfält (körfält A, T, G, C)., DNA-banden kan sedan visualiseras genom autoradiografi eller UV-ljus och DNA-sekvensen kan direkt avläsas av röntgenfilmen eller gelbilden.

figur: Sanger-sekvensering: olika typer av Sanger-sekvensering, som alla beror på sekvensen som stoppas av en terminerande dideoxynucleotid (svarta staplar).,

tekniska variationer av sekvensering av kedjor inkluderar märkning med nukleotider innehållande radioaktiv fosfor för radiomärkning, eller användning av en primer märkt vid 5′ änden med ett fluorescerande färgämne. Färg-primer sekvensering underlättar avläsning i ett optiskt system för snabbare och mer ekonomisk analys och automatisering. Den senare utvecklingen av Leroy Hood och medarbetare av fluorescently märkta ddNTPs och primers satte scenen för automatiserad, hög genomströmning DNA-sekvensering. Kedjetermineringsmetoder har kraftigt förenklat DNA-sekvensering., Mer nyligen har dye-terminator-sekvensering utvecklats. Dye-terminator sekvensering använder märkning av kedjan terminator ddNTPs, som tillåter sekvensering i en enda reaktion, snarare än fyra reaktioner som i den märkta primermetoden. I sekvensering av Dye-terminator är var och en av de fyra dideoxinukleotidkedjeterminatorerna märkta med fluorescerande färgämnen, som var och en avger ljus vid olika våglängder.,

figur: Kromatograf: detta är ett exempel på utmatningen från en Sanger-sekvensering som läses med fluorescentmärkta färgterminatorer. De fyra DNA-baserna representeras av olika färger som tolkas av programvaran för att ge DNA-sekvensen ovan.

automatiserade DNA-sekvenseringsinstrument (DNA-sekvenser) kan sekvensera upp till 384 DNA-prov i en enda sats (körning) på upp till 24 körningar om dagen., DNA-sekvenser utför kapillärelektrofores för storleksseparation, detektering och registrering av färgfluorescens och datautgång som fluorescerande toppspårkromatogram. Automatisering har lett till sekvensering av hela genom.

viktiga punkter

  • bristen på den andra deoxigruppen på en dNTP som gör det ddNTP, stoppar införlivandet av ytterligare nukleotider, denna uppsägning skapar DNA längder stoppas vid varje nukleotid, detta är centralt för att ytterligare identifiera varje nukleotid.,
  • olika etiketter kan användas, ddNTPS, dntps och primers kan alla märkas med radioaktivitet och fluorescently.
  • med hjälp av fluorescerande etiketter kan dideoxisekvensering automatiseras vilket möjliggör hög genomströmning metoder som har använts för att sekvensera hela genom.

nyckeltermer

  • kromatogram: den visuella utgången från en kromatograf. Vanligtvis en grafisk display eller histogram.
  • dideoxinukleotid: varje nukleotid som bildas från en deoxinukleotid genom förlust av en en andra hydroxigrupp från deoxiribosgruppen