Abstrakt

Formål. Sarkoidose er en systemisk granulomatous sykdom med ukjent etiologi. Mange kliniske presentasjoner har blitt rapportert, og akutt sykdom må skilles fra subakutt og kronisk sykdom. Det uforutsigbare kliniske forløpet av sykdommen bedt oss om å evaluere den kliniske nytten av biomarkør serum oppdagelse i sarkoidose oppfølging. Metoder., Serum konsentrasjoner av chitotriosidase, ACE, KL-6, og lysozyme ble analysert av ulike metoder i en befolkning på 74 sarkoidose pasienter (46 på steroid terapi ved prøvetaking) regelmessig evaluert i Siena Sarkoidose Regionale Henvisning Sentrum og i en gruppe av andre kontroller, med sikte på å sammenligne deres bidrag til klinisk behandling av sarkoidose pasienter. Resultat., KL-6 konsentrasjoner var betydelig forhøyet i sarkoidose pasienter med lunge fibrose og var signifikant korrelert med DLco og CPI score, mens chitotriosidase var betydelig høyere hos pasienter med extrapulmonary lokaliseringer. Med en cut-off verdien av 303.5 IU/ml, KL-6 viste den beste følsomhet (78%), mens chitotriosidase rapportert den beste spesifisitet (85%) blant de biomarkører. Konklusjon. KL-6 er en pålitelig biomarkør av fibrotic lunge engasjement i sarkoidose pasienter., Blant biomarkører, KL-6 viste den beste følsomhet og serum chitotriosidase den beste spesifisitet, selv hos pasienter på kronisk steroid terapi, og så ut til å korrelere med extrapulmonary lokaliseringer.

1. Innledning

Sarkoidose er en systemisk granulomatous sykdom assosiert med T-lymfocytt-og macrophage aktivering og migrasjon i berørte organer. Samspillet mellom antigener og APC polarizes T-lymfocytter til T helper 1 fenotypen (Th1), som fører til dannelsen av sarcoid granulomer bestående av T-celler, makrofager, og epithelioid og gigantiske celler ., I løpet av sarkoidose er uforutsigbar: syndenes oppstår i de fleste tilfeller, mens vedvarende granulom betennelse kan føre til fibrotiske lungesykdommer . Spesifikke biomarkører med god sensitivitet og spesifisitet er derfor nødvendig for å forutsi kliniske utfall og guide kliniske beslutninger.

Menneskelige chitotriosidase er en biomarkør som skilles ut av aktiverte makrofager og neutrofiler. Selv om dens fysiologiske rollen er ikke klart, det kan spille en rolle i hydrolyse og nedbrytning av chitin og chitin-lignende underlag ., Økte konsentrasjoner av chitotriosidase har blitt rapportert i serum og BAL av pasienter med aktiv sarkoidose . Chitotriosidase viser en sammenheng med radiologiske stadier. Det kan forutsi kliniske kurset, steroid respons, og potensielle tilbakefall av sykdommen . Det er imidlertid ikke klart om chitotriosidase er pålitelig i behandling av pasienter med sarkoidose extrapulmonary organer er rammet.

Angiotensin-konvertering enzym (ACE) er en syre glykoprotein som omdanner angiotensin jeg inn angiotensin II., Den er produsert av lunge endotelceller, hovedsakelig aktivert alveolære makrofager . Det er forhøyet i serum, og BAL av sarkoidose pasienter og dens konsentrasjoner i samsvar med radiologiske stadier . Imidlertid, sin nytteverdi som et diagnostisk og prognostisk verktøy er begrenset av lav sensitivitet og spesifisitet. ESS kan være forhøyet i visse granulomatous lidelser (inkludert berylliosis og silicosis), hypertyreose, diabetes og andre sykdommer .

Lysozyme er produsert av monocytt-macrophage system og epithelioid celler som er involvert i svulstdannelser kan slippe dette enzymet., Sarkoidose pasienter viser økt konsentrasjon av lysozyme på utbruddet. Lysozyme er betraktet mer som en prognostisk indikator snarere enn et diagnostisk verktøy. Det har en lav spesifisitet være forhøyet i lunge sykdommer som tuberkulose og pneumoconiosis .

Krebs von den Lungen-6 (KL-6) er en menneskelig høy molekylvekt MUC1 mucin protein avledet fra AEC. Sitt serum konsentrasjoner er forhøyet i flere ILDs, inkludert idiopatisk pulmonal fibrose og sarkoidose ., I sarkoidose, KL-6 korrelerer med ACE-aktivitet: det er i hovedsak økt i stadium 2 og 3 pasienter med scintigraphic bevis for positive pulmonal akkumulering . Høye nivåer av serum-KL-6 i sarkoidose reflektere produksjon av KL-6 avledet fra skadet eller gjenoppfriske type 2 pneumocytes .

I denne studien sammenlignet vi serum nivåer av ulike biomarkører i en kohort av pasienter med kronisk sarkoidose sett etter sammenhenger med spesifikke phenotypes, klinisk presentasjon, og lokaliseringer.

2. Materialer og Metoder

2.1., Studiepopulasjonen

Vi har i ettertid meldt inn 74 sarkoidose pasienter (27 menn (36.5%), med en gjennomsnittlig alder i år) regelmessig evaluert i Siena Regionale Henvisning Senter for Sarkoidose og ILDs. Alle pasientene ble diagnostisert i henhold til internasjonale ATS/ERS/WASOG kriterier. Alle hadde vært i oppfølging ved vårt senter for mer enn 2 år siden diagnose og viste en vedvarende kronisk sykdom. Grunnlag for utelukkelse inkludert pasienter med Lofgren syndrom, akutt sykdom utbruddet, spontan oppløsning, eller en oppfølging av mindre enn 2 år.,

Serum prøvetaking ble utført på påmelding: på samme dag, lungefunksjonen test (PFT) og brystet X-ray, med radiologiske klargjøres i henhold til Scadding kriterier , ble utført. Den radiologiske klassifisering var knyttet til eksempel deteksjon i en standard måte i henhold til allment aksepterte kriterier: stage 0, normal; fase 1, bilaterale hilar adenopathy uten parenkymatøs engasjement; fase 2, bilaterale adenopathy og parenkymatøs infiltrasjon; fase 3, parenkymatøs infiltrasjon; og stadium 4, pulmonal fibrose forbundet med sarkoidose., Alle pasienter gjennomgikk høy oppløsning CT-skanning av brystet (HRCT) for å kontrollere for pulmonal fibrose. Alle fag ga sitt informerte samtykke til undersøkelsen, som er godkjent av Lokale Etikk-Komiteen. For å finne en cut-off verdien av serum-KL-6 i vår befolkning, vi har samlet inn serumprøver fra 25 friske frivillige (6 menn, gjennomsnittsalderen år), med ingen historie med luftveissykdommer og ikke tar noen medisiner

2.2., Lungefunksjonen Tester

følgende lungefunksjonen målinger ble utført i henhold til ATS/ERS standard parametere , ved hjelp av et Jaeger Kroppen Plethysmograph med korreksjoner for temperatur og barometertrykk: forced expiratory volume i den første sekund (FEV1), forced vital capacity (FVC), og diffuse lunge karbonmonoksid (DLCO). Alle parametere ble uttrykt som prosentandeler av predikerte verdier .

2.3., Kliniske Phenotyping

Pasientene ble klassifisert på grunnlag av radiologiske lunge engasjement og sarkoidose lokaliseringer, i henhold til de siste Genotype-Fenotype Forhold i Sarkoidose dokument (GenPhenReSa) , samt kompositt fysiologisk indeksen (KPI) score. Vi beregnet KPI i hver pasient i henhold til følgende formel, som tidligere beskrevet : 91 − ( spådd DLCO) − ( spådd FVC) + .,

Extrapulmonary lokaliseringer av sykdom, ble vurdert med organ-spesifikke diagnostiske trasé: nivå av lever, milt, bein, bein marg, extrathoracic lymfeknuter, og huden var alle biopsi bevist, mens ved lokalisering ble vurdert med MR imaging.

2.4. Chitotriosidase Analysen

Chitotriosidase aktivitet ble bestemt av en fluorimetric metoden bruker 22 µM 4-methylumbelliferyl β-D-N,N,N-triacetylchitotriosidase (Sigma Chemical Co.) i citrate-fosfat buffer, pH 5.2; 100 µl substratet ble inkubert for 1 time ved 37°C og reaksjonen ble stoppet med 1,4 ml 0.,1 M glysin-NaOH-buffer, pH 10.8. Fluorescens ble lest på 450 nm med en PerkinElmer Victor X4 fluorimeter (eksitasjon bølgelengde 365 nm). Serum aktivitet av chitotriosidase ble uttrykt i nmol/ml/t. Normalitet verdier ble beregnet i henhold til våre tidligere studier .

2.5. ACE-Analysen

ACE aktivitet ble målt ved hjelp av en kolorimetrisk metode (LANGT srl, Verona, Italia), for bestemmelse av ACE-aktivitet i serum. Normal rekkevidde av ACE-konsentrasjoner var 30-80 IU/l .

2.6. Lysozyme Analysen
2.7., Krebs von den Lungen-6-Analysen

Serum KL-6 ble målt ved NANOPIA® KL-6 reagenser analyse (Sekisui-Diagnostikk, UK). Prinsippet for analysen er agglutinasjon av sialylated karbohydrat-antigen i prøver med KL-6 monoklonalt antistoff gjennom antigen-antistoff reaksjon. Endringen i absorbans måles for å bestemme serum KL-6 nivåer. KL-6 konsentrasjoner er uttrykt i IU/ml.

2.8. Statistiske Analyser

data som ble uttrykt som . Sammenligninger mellom grupper ble utført av Mann-Whitney test og Kruskal-Wallis-test med betydning sett på ., Den Spearman test ble brukt til å se etter sammenhenger mellom variabler. Statistisk analyse og ROC-kurver ble utført ved hjelp av Statistica v 7.0; grafiske fremstillinger av data ble utført ved å bruke GraphPad Prism 4.0 programvare.

3. Resultater

3.1. Klinisk, Radiologisk og Funksjonelle Parametre

Demografiske funksjoner, lungefunksjonen test verdier, og Scadding radiologiske stadier av befolkningen er rapportert i Tabell 1. Som forventet , utbruddet i hovedsak skjedd i 5. tiår ( år), som er utbredt i aldri-røyker kvinner., Om medisinsk historie, 46 pasienter (62%, 17 menn) var på steroid terapi på den tiden av serum prøvetaking, med en gjennomsnittlig dose av av prednison. Av disse, alle bortsett fra én, var å ta orale steroider for mer enn ett år. 13 pasienter (3 hanner) var å ta immundempende medikamenter i kombinasjon med orale steroider (12 med metotreksat, 1 med azatioprin). Blant steroid-gratis undergruppe (28 pasienter, 10 menn), bare to pasienter hadde aldri tatt spesifikk terapi for sarkoidose.,

I vår befolkning, PFT parametere var i det normale området med ingen signifikant endring av lunge volum: 63 pasienter klarte å utføre en akseptabel manøvrere for DLCO som var mildt nedsatt, i gjennomsnitt.

3.2. Sammenligning av Biomarkører

Serum KL-6 konsentrasjon var beregnet på alle pasienter og friske frivillige; ACE og lysozyme ble oppdaget i serum av alle pasienter. Seks pasienter med chitotriosidase aktivitet <10 nmol/ml/h var mistenkt for å ha CHIT1 polymorphism og ble ekskludert fra analysen.,

Ingen signifikante forskjeller av biomarkører’ nivåer ble funnet mellom pasienter som behandles med steroider, og de behandles med steroider og immunsuppressiv terapi.

KL-6 var signifikant korrelert med ESS (; ), lysozyme (; ), og chitotriosidase aktivitet (; ) (Figur 1).,


(a)

(b)

(c)


(a)
(b)
(c)

Figure 1
KL-6 correlations with ACE, chitotriosidase, and lysozyme. , ; , ; , .

3.3. Organ Involvement and Phenotypes

The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., Den vanligste extrapulmonary lokaliseringer ble huden (16 pasienter, 21.6%), milt (11 pasienter, 14.8%), og leveren (5 pasienter, 6.7%). Mindre vanlige lokaliseringene var øynene (3 pasienter, 4% av tilfellene) og extrathoracic lymfeknuter (3 pasienter, 4%); CNS (2 pasienter 2,7% av tilfellene) og hjerte -, bein, eller benmarg engasjement (1.3% av tilfellene). Sarkoidose pasienter med extrapulmonary engasjement hadde betydelig høyere chitotriosidase aktivitet enn de med begrenset lungesykdom (; ) (Figur 3). Ingen andre signifikante forskjeller ble observert i forbindelse med organet lokaliseringer.,

– >

Figur 3
Sammenligning av chitotriosidase aktivitet mellom sarkoidose pasienter med og uten extrapulmonary lokaliseringer. .

I forhold til GenPhenReSa phenotypes, pasienter med mage-engasjement () viste signifikant høyere chitotriosidase aktivitet enn de med okulær-hjerte-kutan-central nervous system (OCCC) (), muskel-kutan (), og isolert pulmonal engasjement () (, henholdsvis; )., Ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom KL-6, ESS, og lysozyme nivåer i disse undergruppene.

Ifølge for å radiologiske score, pasienter med fibrotic sarkoidose (stadium 4) viste de høyeste konsentrasjonene av serum-KL-6 i forhold til de andre radiologiske stadier av sykdommen () (Figur 4).

– >

Figur 4
Sammenligning av KL-6 konsentrasjon blant RX stadier i sarkoidose befolkningen. .

4., Diskusjon

Mange biomarkører har vært foreslått for sarkoidose, men ingen har vist tilfredsstillende prognostisk verdi for å identifisere tilbakefall under behandling eller vitale organ lokalisering. I denne studien sammenlignet vi forskjellige sarkoidose biomarkører. Vi valgte kronisk sykdom pasienter i behandling for mer enn 1 år med kliniske og demografiske data som er kompatible med den generelle funksjoner av sarkoidose er rapportert i litteraturen . Vi inkluderte KL-6 i listen av biomarkører, selv om dette proteinet har blitt studert i IPF og lite data er tilgjengelig på sin rolle i sarkoidose., Vår interesse i KL-6 var knyttet til dens rapportert sammenheng med alvorlig fibrotic lunge engasjement og dårlig overlevelse . Chitotriosidase, ESS, og lysozyme viste en lavere prevalens i befolkningen enn tidligere observert, sannsynligvis fordi de fleste pasienter på langtids systemisk behandling med steroider og ikke vise tegn på aktiv sykdom på den tiden av serum prøvetaking. Tvert imot, KL-6 viste en god sensitivitet og spesifisitet i vår befolkning, med en cut-off verdien av 303.5 IU/ml., Vår kunnskap, er dette den første studien å undersøke en bestemt cut-off verdien av KL-6 i kronisk sarkoidose mot en gruppe av friske kontroller, men dette var ikke det viktigste målet for studien og data må være validert i en større kohort av pasienter. Våre funn bekreftet den prediktive verdien av KL-6 for fibrotic lunge engasjement og funksjonell svekkelse i ILD sarkoidose pasienter som allerede er rapportert av Miyoshi et al., ; men vår studie er den første som viser en signifikant korrelasjon mellom serum biomarkør, KL-6, og pulmonal fibrotic lunge engasjement i sarkoidose pasienter, kvantifisert ved KPI-indeksen. Videre, dette funnet er ytterligere bekreftet av en betydelig korrelasjon med DLCO prosenter, opprettholde den potensielle nytten av KL-6 målinger for å vurdere sarkoidose alvorlighetsgraden i den kliniske behandlingen av disse pasientene., Disse dataene ble konsekvent uansett terapi status, noe som tyder på en kronisk macrophage aktivering svarer til steroid terapi, spesielt hos pasienter med fibrotiske lungesykdommer. Ingen signifikante forskjeller i KL-6 uttrykket ble funnet blant kliniske phenotypes og/eller extrapulmonary lokaliseringer, som indikerer at KL-6 kan anses som pålitelige bare for pulmonal involvering av sykdom. Positive korrelasjoner ble funnet blant sarkoidose biomarkører, inkludert ESS, lysozyme, chitotriosidase, og KL-6 det kan derfor være inkludert i listen av prognostiske indikatorer.,

På den annen side, chitotriosidase vært mer sensitive enn ESS, lysozyme, og KL-6 selv hos pasienter under systemisk behandling, og det synes også å være den eneste biomarkører som kan reflektere extrathoracic engasjement, i henhold til de siste GenPhenReSa kliniske fenotypen klassifisering., I særdeleshet, dens uttrykk er mer uttalt hos pasienter med mage-organ lokaliseringer (leveren og milten, i vår befolkning), sannsynligvis på grunn av en overexpression ved aktivert bosatt makrofager; disse dataene tyder på at chitotriosidase kan være en pålitelig markør for aktivering av reticuloendothelial system i sarkoidose, som tidligere er rapportert hos pasienter med lysosomal lagring sykdom . Ingen studier er tilgjengelige på chitotriosidase prognostisk verdi i splenic og nedsatt sarkoidose lokaliseringer og dette er en relevant nyhet i denne studien., I motsetning til KL-6, chitotriosidase aktivitet synes ikke å være korrelert med alvorlighetsgraden av sarcoid pulmonal engasjement eller funksjonell svekkelse, noe som tyder på at ulike mønstre av macrophage aktivering kan være til stede i luftveiene av sarkoidose pasienter og innflytelse biomarkører’ uttrykk .

I konklusjonen, pasienter med kroniske sarkoidose, alvorlig extrapulmonary engasjement, eller trinn 4 fibrotic verdifall representerer et viktig mål som krever identifisering av pålitelig prognostiske biomarkører for å forutsi sykdom tilbakefall og svar til systemisk behandling.,

Basert på disse foreløpige resultater, høye nivåer av chitotriosidase og KL-6 (og ikke ESS eller lsysozyme) ble observert i kroniske sarkoidose pasienter, uavhengig terapi. Chitotriosidase aktivitet var betydelig høyere hos pasienter med en flere organer er rammet, viser en lovende pålitelighet for evaluering multisistemic sarkoidose. Tvert imot, KL-6 nivåer korrelert med fibrotic lunge engasjement, CPI-score, og redusert DLCO prosenter foreslå en potensiell rolle som en markør av alvorlighetsgraden av pulmonal sarkoidose., Det er interessant at disse funnene ble rapportert i en populasjon av kronisk multiorgan sarkoidose pasienter, inkludert de som er på behandling, utvide reliability av chitotriosidase og KL-6 også i denne innstillingen.

Data

datasett generert under og/eller som ble analysert i denne studien er tilgjengelig fra samme forfatter på rimelig forespørsel. Data er tilgjengelig fra Laura Bergantini ([email protected]) og Elena Bargagli ([email protected]) for forskere som oppfyller kriteriene for å få tilgang til konfidensielle data.,

Interessekonflikter

forfatterne hevder at de har ingen interessekonflikter.

Forfatternes Bidrag

Laura Bergantini og Francesco Bianchi like bidratt til studien.

Erkjennelsene

Det foreliggende arbeidet ble utført i Siena Universitetet.