PMC (Norsk)

TEKST

Natalizumab, et antistoff som brukes til å behandle relapsing multippel sklerose (MS), forhindrer menneskehandel aktiverte lymfocytter, inkludert autoreactive lymfocytter, gjennom blod-hjerne-barrieren (BBB). Den viktigste negative effekten av natalizumab er progressiv multifokal leukoencefalopati (PML), en ødeleggende demyeliniserende sykdom forårsaket av replikering av menneskelig JC polyomavirus (JCV) i oligodendrocytes og astrocyttene (1, 2)., Natalizumab hemming av effector T-celle menneskehandel fra blod til det sentrale nervesystemet (CNS) kan favorisere lokale JCV replication (3-7).

Her har vi undersøkt forekomsten av JCV-spesifikke effector minne T-celler (TEM) i blodet av MS-pasienter etter natten antigen aktivering ex vivo. In vivo, bestemte TEM tall nedgang når cognate antigen er fjernet (8-10), og deres tilstedeværelse kan dermed peke til pågående JCV replikering. TEM raskt utgivelsen cytokiner som interferon gamma (IFN-γ) når reexposed til antigenet., En tidligere enzymkoblet immunsorbent spot-analysen (ELISPOT) undersøkte IFN-γ uttrykk i T-celler følgende langsiktige aktivering med JCV peptider for opp til 14 dager (11). Men langvarig aktivering gir langsiktig hvilestrøm T-celle minne til å bli aktivert på nytt og for å utvide, noe som betyr at en positiv respons trenger ikke nødvendigvis bety en pågående immunrespons. Her er vi først undersøkt forekomsten av JCV-spesifikke TEM i to MS-pasienter som utviklet PML. Den første pasienten ble diagnostisert med PML etter 39 måneder på natalizumab (39 infusjoner) (Institutt for Nevrologi, Pitié-Salpétrière Sykehus)., Hun var 39 år gammel, og hadde et 10-års historie av relapsing-remitting MS. Før natalizumab, hadde hun fått cyclophosphamide og mitoksantron. PML ble bekreftet av MR og JCV PCR på cerebrospinalvæsken (CSF). Når det testes for JCV-spesifikke TEM, 8 uker etter PML symptom debut, hun hadde 1,040 JCV genom kopier per ml CSF (JCV Q-PCR Varsling kit; Nanogen Avansert Diagnostikk). Hennes perifert blod mononukleære celler (PBMC) ble aktivert in vitro i SIKTE-V og Albumax medium (Invitrogen) for 16 h med rensede JCV (belastning MAD-4; LGC Promochem; 104.5 50% vev kultur infective dose /0,2 ml)., Ingen rekombinant interleukin 2 (IL-2) ble lagt. En mengde virus tilsvarende 5,534 PFU ble lagt til hver brønn. Dette tilsvarte et mangfold av infeksjon (MOI) på 0,02. Cellene ble deretter testet for intracellulære IFN-γ ved flowcytometri. Celle dødelighet følgende natten aktivering var mindre enn 5%. Som vist i Fig. 1A og andB,B, svarer celler ble oppdaget i både CD4 og CD8 T-celle undergrupper, og de fleste av dem hadde CCR7− CD45RA− fenotypen karakteristiske minne effektorer (12)., Anti-JCV TEM ble også oppdaget av IFN-γ ELISPOT (fange opp og påvise antistoffer, kloner 1-D1 og K7-B6-1, henholdsvis; Mabtech) følgende 16 h av aktivering med rensede JCV eller VP-1 peptider (en blanding av 14 bassenger av overlappende 15-amino-acid peptider som dekker hele JCV VP-1 protein ) (Fig. 1C). Den andre pasienten var 46 år gammel, og hadde en 11-års historie av relapsing-remitting MS. Før natalizumab, hadde hun fått beta-interferon, glatiramer acetat, azatioprin, og mitoksantron. Hun ble henvist til Tenon Sykehus MS-senter for reevaluation etter 24 natalizumab infusjoner., En brain MR utført i Mai 2012 oppdaget en liten, lineære, T2-hyperintense mistenkelig lesjon i juxtacortical høyre frontal området. Den første CSF-prøven var negativ for JCV. Gjenta MR etter natalizumab uttak viste en økning i lesjon størrelse, noe som fører til ytterligere to CSF undersøkelser, som begge var negative for JCV. JCV PCR på plasma ble utført 2 og 4 måneder etter utbruddet av PML. Både plasma prøver var negative. Hjernen biopsi utført i September 2012 endelig bekreftet diagnosen av PML.,

ELISPOT analyse av IFN-γ-svar til JCV, utført 2 dager etter den siste natalizumab infusjon, viste tilstedeværelse av JCV-spesifikke TEM i blodet (Fig. 1C). Interessant, sirkulerer JCV-spesifikke TEM tallene var lavere enn i den første PML pasienten, som kan ha hatt et høyere nivå av JCV-replikering i hjernen, som JCV PCR på CSF var positiv i den første pasienten og negative i den andre.,

Vi også undersøkt forekomsten av JCV-spesifikke TEM med ELISPOT i en serie av 62 MS-pasienter med relapsing-remitting MS behandling med natalizumab i henhold til den Europeiske markedsføring vilkårene, så vel som i 35 MS-pasienter som ikke var mottatt noen sykdomsmodifiserende behandling, og en gruppe på 40 friske givere matchet for alder og kjønn med MS-pasienter. Egenskapene til MS-pasienter er vist i Tabell 1. Pasienter og friske givere ga sitt skriftlige samtykke til å delta i studien, som ble godkjent av etisk komité av Pitié-Salpêtrière Hospital, Paris., En ELISPOT svar ble ansett som positivt hvis den korrigerte antall plasser (antall plasser i aktivert brønner minus antall plasser i ubehandlet brønner) var minst 10, med færre enn 10 flekker i ubehandlet brønner.

andelen positive prøver var 2,5% i friske givere (Fig. 2A). I MS-gruppen, andel av positive pasienter økte med tiden på natalizumab (Fig. 2B og andC),C), fra 8.8% i ubehandlet MS-pasienter til 15.9% hos pasienter behandlet med natalizumab for mindre enn 24 måneder og 27% blant pasienter behandlet for mer enn 24 måneder (Fig., 2C) (betydelig for pasienter behandlet i mer enn 24 måneder versus ubehandlet MS og versus kontroll fag ). Denne økningen i frekvensen av påvisning av JCV TEM svar foreslått at langvarig natalizumab behandling favoriserte JCV reaktivering.

– >

Et delsett av natalizumab-behandlede pasienter ble prøvetatt minst to ganger (se Tabell 1). Som vist i Fig. 2D, de fleste av disse pasientene enten ble eller holdt seg positivt under prøvetaking periode.,

nyrene er et stort reservoar for JCV. En betydelig andel av befolkningen excretes viruset i urinen, men har ingen bevis for JCV i blodet (13-15). I tillegg, tilstedeværelsen av JCV-DNA i hjernen ser ut til å være uavhengig av sin tilstedeværelse i nyrene (16). Som vist i Fig. 2E, 60% av MS-pasienter med synlig JCV TEM i blodet hadde ingen synlig JCV i urinen, og 69% av pasienter med positiv JCV PCR i urinen hadde ingen synlig JCV TEM. JCV urinutskillelse uten påvisbare JCV TEM ble også observert hos friske givere (Fig. 2E)., Dette tyder på at tilstedeværelsen av JCV-replikering i nyrene fører ikke nødvendigvis til påvisbare JCV TEM i blodet. I motsatt fall, dette øker muligheten for at JCV TEM påvisning i blod kan reflektere pågående extrarenal JCV replikering.

I en studie ved hjelp av en roman JCV enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metode (17), estimert seroprevalence av JCV i MS-pasienter behandlet med natalizumab var 53.6% (17). Seropositivity ikke nødvendigvis i samsvar med tilstedeværelse av TEM svar, som er relatert til virus reaktivering., Lang levetid plasma celler som kan vedvare i benmargen for lang tid perioder, kanskje i flere tiår, og for å opprettholde vedvarende serum antistoff uten aktiv patogen replication (18, 19). Vi brukte samme ELISA-metode for å teste 56 av våre natalizumab-behandlet MS-pasienter som hadde blitt testet av JCV ELISPOT, inkludert 2 PML pasienter. Som vist i Fig. 2F, 53.6% av pasientene var seropositive og 16.1% var ELISPOT positive. Tjue-sju prosent av JCV-seropositive pasienter hadde påvisbare JCV TEM i blodet. Bare en pasient som var JCV ELISPOT positive var seronegative., I henhold til Gorelik et al. den falske negative rate av JCV serologiske analysen er 2,5% (17).

Våre resultater viser at frekvensen av påvisning av JCV TEM svar i MS-pasienter øker med tiden på natalizumab. En tidligere studie viste også en økning i T-celle responser til JCV etter 12 måneder av natalizumab behandling, men denne studien var begrenset til 18 måneders behandling (20), mens vi fant at den sterkeste økningen i effector T-celle responser som skjedde etter 24 måneder.,

Våre resultater dermed punkt til JCV reaktivering under natalizumab behandling, inkludert i extrarenal nettsteder. JCV har blitt oppdaget i hjernen av HIV-seronegative personer uten PML (21). Redusert CNS immunosurveillance indusert av natalizumab kan favorisere lokale reaktivering av virus som kan starte som asymptomatiske intermitterende virusreplikasjon, men kan utvikle seg mot vedvarende virus replikasjon og deretter til PML. Virus reaktivering kan aktivere perifer spesifikke T-lymfocytter, via antigenpresenterende celler, på steder som for eksempel hjerne-drenering livmorhalsen lymfeknuter (22-24)., Som natalizumab mål VLA-4-reseptor, disse spesielle cellene kan ikke effektivt å krysse blod-hjerne-barrieren, og kan derfor hope seg opp i blodet, tilrettelegging for sin oppdagelse. PML er også en komplikasjon for sent på scenen HIV-infeksjon. Om påvisning av JCV-spesifikke effector CD4 og CD8 T-celler kan gå forut for AIDS-forbundet PML er en severdighet som fortjener en nærmere undersøkelse. Imidlertid, AIDS-forbundet PML er klart forskjellig fra natalizumab-indusert PML., De fleste HIV-infiserte pasienter som utvikler PML har dyp CD4 lymphopenia, som også endrer CD8 T-celle-funksjonalitet gjennom mangel av CD4 hjelp (25). Dessuten, i motsetning til pasienter på natalizumab, det er ingen blokade av T celle menneskehandel gjennom blod-hjerne-barrieren, og dette kan hindre JCV-spesifikke TEM akkumulering i blodet.

Sammen, våre resultater tyder på at funksjonelle analyser i stand til å oppdage JCV-spesifikke TEM svar kan bidra til å identifisere pasienter med risiko for å utvikle PML under behandling med antistoffer som hemmer lymfocytt menneskehandel gjennom blod-hjerne-barrieren.,