En nybegynnerguide til Neste Generasjons Sekvensering (NGS) Teknologi

ferdigstillelse av det Humane Genom-Prosjektet i 2003 innledet en ny epoke på rask, rimelig, og nøyaktig genom analyse—kalt Neste Generasjons Sekvensering (NGS). NGS bygger på «første generasjons sekvensering» teknologier for å gi nøyaktig og kostnadseffektiv sekvensering resultater.

Fred Sanger sekvensert den første hele DNA-genom, virus phage ?X174, i 1977., I samme år som Sanger utviklet fremtiden ryggraden i genome æra: DNA-sekvensering teknologi. Hans teknikk som brukes kjeden oppsigelse metode. Dette er nå sett på som den «første generasjons teknologi» av genom-sekvensering.

Siden Sanger-sekvensering (eller kjede oppsigelse metode) er den første generasjonen av sekvensering teknologi, forstå det er svært viktig. Det Humane Genom-Prosjektet startet med Sanger-sekvensering teknologi.,

Sanger-Sekvensering Metode

Sanger-sekvensering metoden baserer seg på dideoxynucleotides (ddNTPs),en type deoxynucleoside triphosphates (dntp), som mangler et 3′ – hydroksyl gruppe og har et hydrogenatom i stedet . Når disse basene binder seg til den voksende DNA-sekvens, og de avslutter replikering som de ikke kan binde andre baser. For å utføre Sanger-Sekvensering, kan du legge til din primere til en løsning som inneholder den genetiske informasjonen for å bli sekvensert, deler opp løsningen i fire PCR-reaksjoner., Hver reaksjon inneholder en med dNTP mix med en av de fire nukleotider erstattet med en ddNTP (A, T, G og C ddNTP-grupper). På slutten av PCR, hver av de fire reaksjoner vil gi PCR-produkter av ulike lengder fordi replikering er tilfeldig avsluttet. Ved å kjøre prøvene på en gel med 4 kjørefelt, kan du sette sammen den rekkefølge som hver sekvens har blitt kopiert fra den samme originale materialet. Her er et eksempel hvor ddNTPs i fet skrift, og dntp-er ikke:

Din sekvens er ATGCTCAG.,

fire reaksjoner gir deg:
Reaksjon med ddATP: A, ATGCTCA, ATGCTCAG
Reaksjon med ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reaksjon med ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reaksjon med ddTTP: PÅ, ATGCT, ATGCTCAG

Alle de reaksjoner en gang kjøre en gel ville se noe som dette (Bilde av Olwen Reina):

Hver bandet betegner ulike lengder kode. For eksempel, bandet er rett under «A» symboliserer sekvensen: «ATGCTCA»

Fortsatt forvirret?

La oss tenke oss en fest spill. Spillet er en gjetteleken., Her er hvordan det spilles:

Du tenker på et tall, og konsernet har til å gjette det. Den vanskelige delen er at antallet er 200-sifrene i lengden. Du leser sifrene i nummeret i hodet uten å lage en lyd. Hver så ofte en person er til skade deg, og du forteller dem ensifret du var bare tenker og hvor det er i sekvens av 200. Hver gang du blir avbrutt, må du starte på nytt. Du forlater etter et par timer og konsernet har for å finne ut 200-sifret nummer., De har til å sette sammen den informasjonen du ga dem, for eksempel den 25. tallet var 5, og 40-tallet var 0, og så videre. Ved hjelp av informasjon fra deres avbrudd, kan de gjenta nummeret de gav deg.

Mens dette høres ut som lamest spillet i verden, det fungerer veldig bra for sekvensering!

Dessverre, den er treg, dyre, og (tidligere) er avhengig av radioaktivt materiale. Dette presset forskere til å utvikle nye og bedre former for genom-sekvensering.,

Neste Generasjons Sekvensering Teknologier

Den største fremskritt i genom-sekvensering har vært økende hastighet og nøyaktighet, noe som resulterer i reduksjon i bemanning og kostnader. Hastigheten er takket være parallell analyse og høy gjennomstrømning teknologi. Det er forskjellen mellom å få en 4 år gammel for å lese Moby Dick og gi et avsnitt hver til en haug med Drama majors og ber dem om å lese på en gang.

Sekvensering maskiner har økt enormt siden Sanger utviklet sin metode., I 1987, Applied Biosystems ble den første til å innføre en automatisk sekvensering maskin, kalt AB370. Maskinen lettelse opp på en metode som kalles kapillær elektroforese som brukes Sanger er kjeden avslutte metode uten at du trenger en gel.

Fluorescentmerkede merket kjede-avslutning ddNTPs er lagt til PCR-reaksjonen blanding. Med Sanger-sekvensering metode, PCR-produkter av ulike lengder er opprettet, og deretter skilt i henhold til deres størrelse. Størrelse målt ved PCR-produktet er samlet negativ ladning. Den mer negative ladningen, jo lengre fragment., Ta eksempelet ovenfor med ddNTP inkorporering og forestill deg at fet skrift er ddNTPs med en fluorkrom festet. Som fragmenter er trukket mot den positive elektroden av en kapillær (se bilde nedenfor), passerer de en laserstråle som utløser en lysstråle fra fluorkrom festet til ddNTP som er karakteristisk for den basen type (for eksempel, grønn for En, gul til T, blå for G, rød for C). På denne måten genom er nøye lese.

Den største forskjellen her var fart og kostnader., AB370 kunne oppdage 96 baser på en gang, 500 baser per dag, og hadde en lese lengde på 600 baser ved hjelp av en parallell analyse og høy gjennomstrømning oppsett. Denne formen for sekvensering ble den viktigste verktøy for gjennomføring av det humane genom-prosjektet.

Hvordan Gjør NGS i forhold til Første Generasjons Sekvensering?

NGS er preget av forbedret nøyaktighet og hastighet, men også redusert bemanning og kostnader. Det har aldri vært en tid hvor det har blitt så billig, praktisk, eller grei å arrangere et genom., Uten tvil, den største forbedringen har vært utviklingen av parallelle analyser, noe som økte sekvensering hastighet.

Den eneste bremse oss ned nå er tolkningen av resultatene!