7.13 F: DNA-Sekvensering Basert på Sanger Dideoxynucleotides

Sanger-sekvensering, også kjent som kjede-avslutning-sekvensering, refererer til en metode for DNA-sekvensering utviklet av Frederick Sanger i 1977. Denne metoden er basert på amplifikasjon av DNA-fragment å bli sekvensert ved DNA-polymerase og inkorporering av endret nukleotider – spesifikt, dideoxynucleotides (ddNTPs).,

Den klassiske kjede-oppsigelse metoden krever en single-strandet DNA-templat, en DNA-primer, en DNA polymerase, normal deoxynucleotidetriphosphates (dntp), og endret nukleotider (dideoxyNTPs) som avslutte DNA-strand strekning. Disse chain-avslutning av nukleotider mangler 3′-OH-gruppen er nødvendig for dannelsen av en phosphodiester bånd mellom to nukleotider, noe som fører DNA-polymerase til å stanse utvidelsen av DNA-når en ddNTP er innarbeidet. Den ddNTPs kan være radioactively eller fluorescentmerkede merket for deteksjon i automatiserte sekvenser maskiner.,DNA-prøven er delt inn i fire separate sekvenser reaksjoner, som inneholder alle de fire standard deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP og dTTP) og DNA-polymerase. Hver reaksjon er lagt til bare én av de fire dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, eller ddTTP). Følgende runder av templat DNA-utvidelsen fra bundet primer, den resulterende DNA-fragmentene er varme denaturert og atskilt med størrelse ved hjelp av gelelektroforese. Dette er ofte utført ved hjelp av en denaturing polyakrylamid-urea-gel med hver av de fire reaksjoner kjøre i en av de fire individuelle kjørefelt (kjørefelt A, T, G, C)., DNA-båndene kan da bli visualisert ved autoradiography eller UV-lys og DNA-sekvens kan være direkte lese av X-ray-film eller gel-bilde.

Tekniske varianter av kjede-oppsigelse sekvensering inkluderer merking med nukleotider som inneholder radioaktive fosfor for radiolabelling, eller bruke en primer som er merket i 5′ – enden med et fluorescerende fargestoff. Dye-primer-sekvensering forenkler lesing i et optisk system for raskere og mer økonomisk analyse og automatisering. Den senere utvikling av Leroy Hood og kolleger av fluoriserende fargestoff ddNTPs og primere sette scenen for automatisert, høy gjennomstrømning DNA-sekvensering. Kjede-oppsigelse metodene har i stor grad forenklet DNA-sekvensering., Mer nylig, dye-terminator-sekvensering har blitt utviklet. Dye-terminator sekvensering benytter merking av kjeden terminator ddNTPs, som tillater sekvensering i en enkelt reaksjon, snarere enn fire reaksjoner som i merket-primer-metoden. I dye-terminator-sekvensering, hver av de fire dideoxynucleotide kjede terminators er merket med fluorescerende fargestoffer, som hver sender ut lys på forskjellige bølgelengder.,

Automatisert DNA-sekvensering instrumenter (DNA sequencere) kan sekvens opp til 384 DNA-prøver i en enkelt batch (kjør) i opptil 24 går en dag., DNA sequencere gjennomføre kapillær elektroforese for størrelse separasjon, deteksjon og registrering av farge fluorescens, og utdata som fluorescerende topp spore chromatograms. Automatisering har ført til sekvensering av hele genomer.