Abstract
Zweck. Sarkoidose ist eine systemische granulomatöse Erkrankung mit unbekannter ätiologie. Es wurden viele klinische Präsentationen berichtet, und akute Erkrankungen müssen von subakuten und chronischen Erkrankungen unterschieden werden. Der unvorhersehbare klinische Verlauf der Erkrankung veranlasste uns, den klinischen Nutzen des Biomarker-Serum-Nachweises bei der Sarkoidose-Nachsorge zu bewerten. Methoden., Serumkonzentrationen von Chitotriosidase, ACE, KL-6 und Lysozym wurden mit verschiedenen Methoden in einer Population von 74 Sarkoidose-Patienten (46 zur Steroidtherapie bei der Probenahme) analysiert, die regelmäßig im regionalen Überweisungszentrum von Siena überwacht wurden und in einer Gruppe von Kontrollen mit dem Ziel, ihren Beitrag zum klinischen Management von Sarkoidose-Patienten zu vergleichen. Suchergebnisse., Die KL-6-Konzentrationen waren bei Sarkoidose-Patienten mit Lungenfibrose signifikant erhöht und korrelierten signifikant mit dem DLco-und CPI-Score, während die Chitotriosidase bei Patienten mit extrapulmonalen Lokalisationen signifikant höher war. Mit einem Grenzwert von 303,5 IE / ml zeigte KL-6 die beste Empfindlichkeit (78%), während Chitotriosidase die beste Spezifität (85%) unter den Biomarkern berichtete. Rückschlüsse. KL-6 ist ein zuverlässiger Biomarker der fibrotischen Lungenbeteiligung bei Sarkoidose-Patienten., Unter den Biomarkern zeigte KL-6 die beste Empfindlichkeit und Serumchitotriosidase die beste Spezifität, selbst bei Patienten mit chronischer Steroidtherapie, und schien mit extrapulmonalen Lokalisationen zu korrelieren.
1. Einführung
Sarkoidose ist eine systemische granulomatöse Erkrankung, die mit der Aktivierung und Migration von T-Lymphozyten und Makrophagen in die betroffenen Organe einhergeht. Die Wechselwirkung zwischen Antigenen und APC polarisiert T-Lymphozyten zum T-1-Phänotyp (Th1), was zur Bildung von sarkoiden Granulomen führt, die aus T-Zellen, Makrophagen sowie Epithelioid-und Riesenzellen bestehen ., Der Verlauf der Sarkoidose ist unvorhersehbar: In den meisten Fällen tritt eine Remission auf, während eine anhaltende Granulomentzündung zu einer fibrotischen Lungenerkrankung führen kann . Spezifische Biomarker mit guter Sensitivität und Spezifität sind daher erforderlich, um das klinische Ergebnis vorherzusagen und klinische Entscheidungen zu leiten.
Die humane Chitotriosidase ist ein Biomarker, der von aktivierten Makrophagen und Neutrophilen abgesondert wird. Obwohl seine physiologische Rolle nicht klar ist, kann es eine Rolle bei der Hydrolyse und dem Abbau von Chitin und chitinähnlichen Substraten spielen ., Erhöhte Konzentrationen von chitotriosidase wurden in serum-und BAL von Patienten mit aktiver Sarkoidose . Chitotriosidase zeigt eine Korrelation mit radiologischen Stadien. Es kann den klinischen Verlauf, die Steroidreaktion und mögliche Rückfälle der Krankheit vorhersagen . Es ist jedoch nicht klar, ob Chitotriosidase bei der Behandlung von Sarkoidose-Patienten mit extrapulmonaler Organbeteiligung zuverlässig ist.
Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) ist ein saures Glykoprotein, das Angiotensin I in Angiotensin II umwandelt., Es wird von Lungenendothelzellen produziert, hauptsächlich aktivierten Alveolarmakrophagen . Es ist in Serum und BAL von Sarkoidose-Patienten erhöht und seine Konzentrationen korrelieren mit radiologischen Stadien . Sein Nutzen als Diagnose-und Prognosewerkzeug ist jedoch durch seine geringe Empfindlichkeit und Spezifität begrenzt. ACE kann bei bestimmten granulomatösen Störungen (einschließlich Berylliose und Silikose), Hyperthyreose, Diabetes und anderen Krankheiten erhöht sein .
Lysozym wird vom Monozyten-Makrophagen-System produziert und Epitheloidzellen, die an der Granulombildung beteiligt sind, können dieses Enzym freisetzen., Sarkoidose-Patienten zeigen zu Beginn eine erhöhte Lysozymkonzentration. Lysozym wird eher als prognostischer Indikator als als als diagnostisches Werkzeug angesehen. Es hat eine geringe Spezifität, die bei Lungenerkrankungen wie Tuberkulose und Pneumokoniose erhöht ist .
Krebs von den Lungen-6 (KL-6) ist ein menschliches MUC1-Mucin-Protein mit hohem Molekulargewicht, das aus AEC gewonnen wird. Seine Serumkonzentrationen sind in mehreren ILDs erhöht, einschließlich idiopathischer Lungenfibrose und Sarkoidose ., Bei der Sarkoidose korreliert KL-6 mit der ACE-Aktivität: Es ist hauptsächlich bei Patienten im Stadium 2 und 3 mit szintigraphischen Anzeichen einer positiven Lungenakkumulation erhöht . Hohe Serum-KL-6-Spiegel bei Sarkoidose spiegeln die Produktion von KL-6 wider, das aus geschädigten oder regenerierenden Typ-2-Pneumozyten stammt .
In dieser Studie verglichen wir die Serumspiegel verschiedener Biomarker in einer Kohorte von Patienten mit chronischer Sarkoidose und suchten nach Korrelationen mit spezifischen Phänotypen, klinischer Präsentation und Lokalisationen.
2. Materialien und Methoden
2.1., Studienpopulation
Wir haben retrospektiv 74 Sarkoidose-Patienten (27 Männer (36,5%) mit einem Durchschnittsalter von Jahren) eingeschrieben, die regelmäßig im regionalen Überweisungszentrum für Sarkoidose und ILDs in Siena überwacht wurden. Alle Patienten wurden nach internationalen ATS/ERS/WASOG-Kriterien diagnostiziert. Alle waren seit der Diagnose mehr als 2 Jahre in unserem Zentrum im Follow-up und zeigten eine anhaltende chronische Krankheit. Die Ausschlusskriterien umfassten Patienten mit Lofgren-Syndrom, akutem Krankheitsbeginn, spontaner Auflösung oder einer Nachsorge von weniger als 2 Jahren.,
Bei der Einschreibung wurde eine Serumprobe durchgeführt: Am selben Tag wurden ein Lungenfunktionstest (PFT) und eine Röntgenaufnahme des Brustkorbs mit radiologischer Inszenierung nach Scadding-Kriterien durchgeführt. Die radiologische Klassifikation wurde auf standardmäßige Weise nach allgemein anerkannten Kriterien mit dem Nachweis von Proben in Verbindung gebracht: Stadium 0, normal; Stadium 1, bilaterale hilare Adenopathie ohne Parenchymbeteiligung; Stadium 2, bilaterale Adenopathie und parenchymale Infiltration; Stadium 3, parenchymale Infiltration; und Stadium 4, Lungenfibrose im Zusammenhang mit Sarkoidose., Alle Patienten wurden einer hochauflösenden CT-Untersuchung der Brust (HRCT) unterzogen, um auf Lungenfibrose zu überprüfen. Alle Probanden gaben ihre informierte Zustimmung zu der Studie, die vom lokalen Ethikkomitee genehmigt wurde. Um einen Grenzwert von Serum KL-6 in unserer Population zu finden, sammelten wir Serumproben von 25 gesunden Freiwilligen (6 Männer, Durchschnittsalter Jahre), ohne Vorgeschichte von Atemwegserkrankungen und ohne Einnahme von Medikamenten
2.2., Lungenfunktionstests
Die folgenden Lungenfunktionsmessungen wurden gemäß den ATS/ERS-Standardparametern unter Verwendung eines Jaeger-Körperplethysmographen mit Korrekturen für Temperatur und Luftdruck durchgeführt: erzwungenes exspiratorisches Volumen in der ersten Sekunde (FEV1), erzwungene Vitalkapazität (FVC) und diffuses Lungenkohlenmonoxid (DLCO). Alle Parameter wurden als Prozentsätze der vorhergesagten Werte ausgedrückt .
2.3., Klinische Phänotypisierung
Patienten wurden klassifiziert auf der basis der radiologischen Lungen-Beteiligung und Sarkoidose Lokalisierungen, nach jüngsten Genotyp-Phänotyp-Beziehung bei Sarkoidose-Dokument (GenPhenReSa) , sowie composite-physiologischen index (CPI) score. Wir berechneten den CPI bei jedem Patienten nach der folgenden Formel, wie zuvor beschrieben: 91 – (vorhergesagte DLCO) − (vorhergesagte FVC) + .,
Extrapulmonale Lokalisationen von Erkrankungen wurden mit organspezifischen diagnostischen Wegen untersucht: Involvierungen von Leber, Milz, Knochen, Knochenmark, extrathorakalen Lymphknoten und Haut wurden alle biopsienbewiesen, während die kardiale Lokalisation mit MR-Bildgebung beurteilt wurde.
2.4. Chitotriosidase Assay
Chitotriosidase-Aktivität wurde bestimmt durch eine fluorometrische Methode mit 22 µM, 4-methylumbelliferyl β-D-N,N,N-triacetylchitotriosidase (Sigma Chemical Co.) in Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,2; 100 µl Substrat wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde mit 1,4 ml 0 gestoppt.,1 M Glycin-NaOH Puffer, pH 10.8. Fluoreszenz gelesen wurde bei 450 nm mit einem PerkinElmer Victor X4 fluorimeter (Anregungswellenlänge 365 nm). Die Serumaktivität der Chitotriosidase wurde in nmol/ml / h ausgedrückt. Normalitätswerte wurden nach unseren vorherigen Studien berechnet .
2.5. ACE-Assay
Die ACE-Aktivität wurde mit einer kolorimetrischen Methode (FAR srl, Verona, Italien) zur Bestimmung der ACE-Aktivität im Serum gemessen. Der normale Bereich der ACE-Konzentrationen betrug 30-80 IE /l.
2.6. Lysozyme Assay
2.7., Krebs von den Lungen-6 Assay
Serum KL-6 wurde mittels NANOPIA® KL-6 assay-Reagenzien (Sekisui Diagnostics, UK). Das Prinzip des Assays ist die Agglutination von sialyliertem Kohlenhydratantigen in Proben mit monoklonalem KL-6-Antikörper durch die Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Änderung der Absorption wird gemessen, um die Serum-KL-6-Spiegel zu bestimmen. KL-6-Konzentrationen werden in IE/ml ausgedrückt.
2.8. Statistische Analyse
Die Daten wurden ausgedrückt als . Vergleiche zwischen Gruppen wurden durch Mann-Whitney-Test und Kruskal-Wallis-Test mit Signifikanz eingestellt durchgeführt ., Der Spearman-Test wurde verwendet, um nach Korrelationen zwischen Variablen zu suchen. Statistische Analysen und ROC-Kurven wurden mit der Software Statistica v 7.0 durchgeführt; grafische Darstellungen von Daten wurden mit der Software GraphPad Prism 4.0 durchgeführt.
3. Ergebnisse
3.1. Klinische, radiologische und funktionelle Parameter
Demografische Merkmale, Lungenfunktionstestwerte und radiologische Stadien der Population werden in Tabelle 1 berichtet. Wie erwartet trat der Ausbruch hauptsächlich im 5.Jahrzehnt ( Jahre) auf, das bei Frauen ohne Raucher vorherrschte., In Bezug auf die Anamnese wurden 46 Patienten (62%, 17 Männer) zum Zeitpunkt der Serumentnahme mit einer durchschnittlichen Dosis von Steroidtherapie behandelt von von Prednison. Von diesen nahmen alle bis auf einen mehr als ein Jahr lang orale Steroide ein. 13 Patienten (3 Männer) nahmen Immunsuppressiva in Kombination mit oralen Steroiden ein (12 mit Methotrexat, 1 mit Azathioprin). Unter der steroidfreien Untergruppe (28 Patienten, 10 Männer) hatten nur zwei Patienten nie eine spezifische Therapie für Sarkoidose erhalten.,
In unserer Population lagen die PFT-Parameter im normalen Bereich ohne signifikante Veränderung des Lungenvolumens: 63 Patienten gelang es, ein akzeptables Manöver für DLCO durchzuführen, das im Durchschnitt leicht beeinträchtigt war.
3.2. Vergleich der Biomarker
Serum-KL-6-Konzentration wurde bei allen Patienten und gesunden Probanden berechnet; ACE und Lysozym wurden im Serum aller Patienten nachgewiesen. Sechs Patienten mit chitotriosidase-Aktivität <10 nmol/ml/h wurden mit Verdacht auf CHIT1 Polymorphismus und wurden von der Analyse ausgeschlossen.,
Es wurden keine signifikanten Unterschiede der Biomarkerspiegel zwischen Patienten gefunden, die mit Steroiden behandelt wurden, und Patienten, die mit Steroiden und immunsuppressiver Therapie behandelt wurden.
KL-6 korrelierte signifikant mit ACE (;), Lysozym (;) und Chitotriosidase-Aktivität (;) (Abbildung 1).,
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(b)
(c)
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3.3. Organ Involvement and Phenotypes
The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., Die häufigsten extrapulmonalen Lokalisationen waren Haut (16 Patienten, 21,6%), Milz (11 Patienten, 14,8%) und Leber (5 Patienten, 6,7%). Weniger häufige Lokalisationen waren die Augen (3 Patienten, 4% der Fälle) und extrathorakale Lymphknoten (3 Patienten, 4%); ZNS (2 Patienten, 2,7% der Fälle) und Herz -, Knochen-oder Knochenmarkbeteiligung (1,3% der Fälle). Sarkoidose-Patienten mit extrapulmonaler Beteiligung hatten eine signifikant höhere Chitotriosidase-Aktivität als Patienten mit eingeschränkter Lungenerkrankung (; ) (Abbildung 3). Keine signifikanten Unterschiede beobachtet wurden, in Zusammenhang mit Orgel Lokalisierungen.,
In Bezug auf GenPhenReSa-Phänotypen zeigten Patienten mit abdominaler Beteiligung () eine signifikant höhere Chitotriosidase-Aktivität als Patienten mit okular-kardial-kutan-Zentralnervensystem (OCCC) (), Muskel-Skelett-kutan () und isolierter Lungenbeteiligung () (bzw.; )., Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den KL-6 -, ACE-und Lysozymspiegeln in diesen Untergruppen gefunden.
Laut radiologischem Score zeigten Patienten mit fibrotischer Sarkoidose (Stadium 4) die höchsten Serumkonzentrationen KL-6 im Vergleich zu den anderen radiologischen Krankheitsstadien () (Abbildung 4).
4., Diskussion
Viele Biomarker wurden für Sarkoidose vorgeschlagen, aber keiner hat einen zufriedenstellenden prognostischen Wert für die Identifizierung von Rückfällen unter Therapie oder lebenswichtiger Organlokalisation gezeigt. In dieser Studie verglichen wir verschiedene Sarkoidose Biomarker. Wir haben Patienten mit chronischen Krankheiten ausgewählt, die länger als 1 Jahr behandelt wurden, wobei klinische und demografische Daten mit den in der Literatur angegebenen allgemeinen Merkmalen der Sarkoidose vereinbar waren . Wir haben KL-6 in die Liste der Biomarker aufgenommen, obwohl dieses Protein in IPF untersucht wurde und nur wenige Daten zu seiner Rolle bei der Sarkoidose vorliegen., Unser Interesse an KL-6 war mit seiner berichteten Korrelation mit schwerer fibrotischer Lungenbeteiligung und schlechtem Überleben verbunden . Chitotriosidase, ACE und Lysozym zeigten eine geringere Prävalenz in unserer Population als zuvor beobachtet, wahrscheinlich weil die meisten Patienten eine langfristige systemische Behandlung mit Steroiden erhielten und zum Zeitpunkt der Serumentnahme keine Anzeichen einer aktiven Erkrankung zeigten. Im Gegenteil, KL-6 zeigte eine gute Empfindlichkeit und Spezifität in unserer Population mit einem Grenzwert von 303,5 IE/ml., Nach unserem Wissen ist dies die erste Studie, die einen spezifischen Grenzwert von KL-6 bei chronischer Sarkoidose im Vergleich zu einer Gruppe gesunder Kontrollen untersucht; Dies war jedoch nicht das Hauptziel der Studie und die Daten müssen in einer breiteren Kohorte von Patienten validiert werden. Unsere Ergebnisse bestätigten den prädiktiven Wert von KL-6 für fibrotische Lungenbeteiligung und funktionelle Beeinträchtigung bei ILD-Sarkoidose-Patienten, die bereits von Miyoshi et al., ; unsere Studie ist jedoch die erste, die eine signifikante Korrelation zwischen einem Serumbiomarker, KL-6, und einer pulmonalen fibrotischen Lungenbeteiligung bei Sarkoidose-Patienten zeigt, quantifiziert durch den CPI-Index. Darüber hinaus wird dieser Befund durch eine signifikante Korrelation mit den DLCO-Prozentsätzen bestätigt, wodurch der potenzielle Nutzen von KL-6-Messungen zur Beurteilung des Schweregrads der Sarkoidose im klinischen Management dieser Patienten aufrechterhalten wird., Diese Daten stimmten unabhängig vom Therapiestatus überein, was auf eine chronische Makrophagenaktivierung hindeutet, die insbesondere bei Patienten mit fibrotischer Lungenerkrankung nicht auf die Steroidtherapie anspricht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede der KL-6-Expression zwischen klinischen Phänotypen und/oder extrapulmonalen Lokalisationen gefunden, was darauf hinweist, dass KL-6 nur für die pulmonale Beteiligung als zuverlässig angesehen werden kann Krankheit. Es wurden positive Korrelationen zwischen Sarkoidose-Biomarkern wie ACE, Lysozym, Chitotriosidase und KL-6 festgestellt, die daher in die Liste der prognostischen Indikatoren aufgenommen werden können.,
Andererseits erwies sich Chitotriosidase auch bei Patienten unter systemischer Behandlung als empfindlicher als ACE, Lysozym und KL-6; Es scheint auch der einzige Biomarker zu sein, der eine extrathorakale Beteiligung widerspiegeln kann, gemäß der jüngsten klinischen Phänotypklassifikation von GenPhenReSa., Insbesondere ist seine Expression bei Patienten mit abdominalen Organlokalisationen (Leber und Milz in unserer Population) ausgeprägter, wahrscheinlich aufgrund einer Überexpression durch aktivierte residente Makrophagen; Diese Daten legen nahe, dass Chitotriosidase ein zuverlässiger Marker für die Aktivierung des retikuloendothelialen Systems bei Sarkoidose sein kann, wie zuvor bei Patienten mit lysosomaler Speicherkrankheit berichtet . Es liegen keine Studien zum prognostischen Wert der Chitotriosidase bei Milz-und Lebersarkoidose-Lokalisationen vor, und dies ist eine relevante Neuheit dieser Studie., Im Gegensatz zu KL-6 scheint die Chitotriosidase-Aktivität nicht mit dem Schweregrad der sarkoiden Lungenbeteiligung oder Funktionsstörung korreliert zu sein, was darauf hindeutet, dass bei Patienten mit Sarkoidose unterschiedliche Muster der Makrophagenaktivierung vorhanden sein können Atmungssystem und Einfluss auf die Expression von Biomarkern .
Zusammenfassend stellen Patienten mit chronischer Sarkoidose, schwerer extrapulmonaler Beteiligung oder fibrotischer Beeinträchtigung im Stadium 4 ein wichtiges Ziel dar, das die Identifizierung zuverlässiger prognostischer Biomarker erfordert, um einen Krankheitsrückfall und ein Ansprechen auf eine systemische Behandlung vorherzusagen.,
Basierend auf diesen vorläufigen Ergebnissen wurden bei Patienten mit chronischer Sarkoidose unabhängig von der Therapie hohe Konzentrationen an Chitotriosidase und KL-6 (und nicht ACE oder Lsysozym) beobachtet. Die Chitotriosidase-Aktivität war bei Patienten mit multipler Organbeteiligung signifikant höher, was eine vielversprechende Zuverlässigkeit für die Bewertung der multisistämischen Sarkoidose zeigte. Im Gegenteil, KL-6-Spiegel, die mit fibrotischer Lungenbeteiligung, CPI-Score und reduzierten DLCO-Prozentsätzen korrelierten, deuten auf eine mögliche Rolle als Marker für die Schwere der pulmonalen Sarkoidose hin., Interessanterweise wurden diese Ergebnisse in einer Population von Patienten mit chronischer Multiorgan-Sarkoidose berichtet, einschließlich Patienten unter Therapie, wodurch die Zuverlässigkeit von Chitotriosidase und KL-6 auch in diesem Umfeld erhöht wurde.
Datenverfügbarkeit
Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die Daten stammen von Laura Bergantini ([email protected]) und Elena Bargagli ([email protected]) für Forscher, die die Kriterien für den Zugang zu vertraulichen Daten erfüllen.,
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
Laura Bergantini und Francesco Bianchi trugen ebenfalls zur Studie bei.
Quittungen
Die vorliegende Arbeit wurde an der Universität Siena durchgeführt.
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