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Natalizumab, ein Antikörper zur Behandlung von rezidivierender Multipler Sklerose (MS), verhindert den Handel mit aktivierten Lymphozyten, einschließlich autoreaktiver Lymphozyten, durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB). Die hauptsächliche nachteilige Wirkung von Natalizumab ist die progressive multifokale Leukoenzephalopathie (PML), eine verheerende demyelinisierende Erkrankung, die durch die Replikation des humanen JC-Polyomavirus (JCV) in Oligodendrozyten und Astrozyten verursacht wird (1, 2)., Die Natalizumab-Hemmung des Effektor-T-Zell-Handels vom Blut zum Zentralnervensystem (ZNS) könnte die lokale JCV-Replikation begünstigen (3-7).

Hier untersuchten wir das Vorhandensein von JCV-spezifischen Effektorgedächtnis-T-Zellen (TEM) im Blut von MS-Patienten nach einer Antigen-Aktivierung über Nacht ex vivo. In vivo nehmen spezifische TEM-Zahlen ab, sobald das kognierte Antigen geklärt ist (8-10), und ihre Anwesenheit kann daher auf eine laufende JCV-Replikation hindeuten. TEM setzt Zytokine wie Gamma-Interferon (IFN-γ) schnell frei, wenn sie erneut Antigen ausgesetzt werden., Ein früherer Enzym-Linked Immunosorbent Spot Assay (ELISPOT) untersuchte die IFN-γ-Expression in T-Zellen nach einer Langzeitaktivierung mit JCV-Peptiden für bis zu 14 Tage (11). Bei längerer Aktivierung kann jedoch das langfristige ruhende T-Zell-Gedächtnis reaktiviert und erweitert werden, was bedeutet, dass eine positive Reaktion nicht notwendigerweise eine anhaltende Immunantwort bedeutet. Hier untersuchten wir zunächst das Vorhandensein von JCV-spezifischem TEM bei zwei MS-Patienten, die PML entwickelten. Bei dem ersten Patienten wurde nach 39 Monaten mit Natalizumab (39 Infusionen) (Abteilung für Neurologie, Pitié-Salpétrière-Krankenhaus) eine PML diagnostiziert., Sie war 39 Jahre alt und hatte eine 10-jährige Geschichte von rezidivierenden remittierenden MS. Vor Natalizumab, sie hatte Cyclophosphamid und Mitoxantron erhalten. PML wurde durch MRT und JCV PCR auf Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) bestätigt. Bei einem Test auf JCV-spezifisches TEM 8 Wochen nach Beginn des PML-Symptoms hatte sie 1,040 JCV-Genomkopien pro ml CSF (JCV Q-PCR Alert Kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Ihre peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) wurden in vitro in AIM-V und Albumax Medium (Invitrogen) für 16 h mit gereinigtem JCV aktiviert (Stamm MAD-4; LGC Promochem; 104,5 50% Gewebekultur infektiöse Dosis /0,2 ml)., Es wurde kein rekombinantes Interleukin 2 (IL-2) hinzugefügt. Zu jedem Brunnen wurde eine Virusmenge hinzugefügt, die 5,534 PFU entsprach. Dies entsprach einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,02. Die Zellen wurden dann durch Durchflusszytometrie auf intrazelluläres IFN-γ getestet. Die Zellmortalität nach Aktivierung über Nacht betrug weniger als 5%. Wie in Abb. 1A und andB,B, reagierende Zellen wurden sowohl in der CD4-als auch in der CD8-T-Zell-Teilmenge nachgewiesen, und die meisten von ihnen hatten den für Memory effectors charakteristischen CCR7− CD45RA− Phänotyp (12)., Anti-JCV-TEM wurden auch durch IFN-γ ELISPOT (Capture and detection antibodies, clones 1-D1 and K7-B6-1, respectively; Mabtech) nach 16 h Aktivierung mit gereinigten JCV-oder VP-1-Peptiden nachgewiesen (eine Mischung aus 14 Pools überlappender 15-Aminosäure-Peptide, die das gesamte JCV VP-1-Protein abdecken) (Abb. 1C). Die zweite Patientin war 46 Jahre alt und hatte eine 11-jährige Geschichte von rezidivierenden remittierenden MS. Vor Natalizumab, sie hatte Beta-Interferon erhalten, Glatirameracetat, Azathioprin, und Mitoxantron. Sie wurde nach 24 Natalizumab-Infusionen zur Neubewertung an das Tenon Hospital MS Center überwiesen., Bei einer im Mai 2012 durchgeführten MRT des Gehirns wurde eine kleine, lineare T2-Hyperintense-Läsion im juxtakortikalen rechten Frontalbereich festgestellt. Die erste CSF-Probe war negativ für JCV. Wiederholte MRT nach dem Entzug von Natalizumab ergab eine Zunahme der Läsionsgröße, was zu zwei weiteren Liquoruntersuchungen führte, die beide negativ für JCV waren. Die JCV-PCR im Plasma wurde 2 und 4 Monate nach Beginn der PML durchgeführt. Beide Plasmaproben waren negativ. Die im September 2012 durchgeführte Gehirnbiopsie bestätigte schließlich die Diagnose von PML.,

Die ELISPOT-Analyse der IFN-γ-Reaktion auf JCV, die 2 Tage nach der letzten Natalizumab-Infusion durchgeführt wurde, zeigte das Vorhandensein von JCV-spezifischem TEM im Blut (Abb. 1C). Interessanterweise waren die zirkulierenden JCV-spezifischen TEM-Zahlen niedriger als beim ersten PML-Patienten, der möglicherweise eine höhere JCV-Replikation im Gehirn hatte, da die JCV-PCR auf CSF beim ersten Patienten positiv und beim zweiten negativ war.,

Wir untersuchten auch das Vorhandensein von JCV-spezifischem TEM durch ELISPOT bei einer Reihe von 62 MS-Patienten mit rezidivierend remittierender MS, die gemäß den europäischen Vermarktungsbedingungen mit Natalizumab behandelt wurden, sowie bei 35 MS-Patienten, die keine krankheitsmodifizierende Therapie erhielten, und einer Gruppe von 40 gesunden Spendern, die auf Alter und Geschlecht mit MS-Patienten abgestimmt waren. Merkmale der MS-Patienten sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Patienten und gesunden Spender gaben ihre schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an der Studie, die von der Ethikkommission des Pitié-Salpêtrière-Krankenhauses in Paris genehmigt wurde., Eine ELISPOT-Reaktion wurde als positiv angesehen, wenn die korrigierte Anzahl von Flecken (Anzahl der Flecken in aktivierten Brunnen abzüglich der Anzahl der Flecken in unbehandelten Brunnen) mindestens 10 betrug, mit weniger als 10 Flecken in unbehandelten Brunnen.

Bei gesunden Spendern betrug der Anteil positiver Proben 2,5% (Abb. 2A). In der MS-Gruppe stieg der Prozentsatz der positiven Patienten mit der Zeit auf Natalizumab (Abb. 2B und andC), C) von 8, 8% bei unbehandelten MS-Patienten auf 15, 9% bei Patienten, die weniger als 24 Monate mit Natalizumab behandelt wurden, und 27% bei Patienten, die länger als 24 Monate behandelt wurden (Abb., 2C) (signifikant für Patienten, die länger als 24 Monate behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelter MS und gegenüber Kontrollpersonen ). Diese Zunahme der Häufigkeit des Nachweises von JCV-TEM-Reaktionen deutete darauf hin, dass eine längere Natalizumab-Behandlung die JCV-Reaktivierung begünstigte.

Eine Teilmenge der mit Natalizumab behandelten Patienten wurde mindestens zweimal abgetastet (siehe Tabelle 1). Wie in Abb. Die meisten dieser Patienten wurden oder blieben jedoch während des Probenahmezeitraums positiv.,

Die Niere ist ein wichtiges Reservoir für JCV. Ein signifikanter Prozentsatz der Allgemeinbevölkerung scheidet das Virus im Urin aus, weist jedoch keine Hinweise auf JCV im Blut auf (13-15). Darüber hinaus scheint das Vorhandensein von JCV-DNA im Gehirn unabhängig von seiner Anwesenheit in der Niere zu sein (16). Wie in Abb. 2E, 60% der MS-Patienten mit nachweisbarem JCV-TEM im Blut hatten kein nachweisbares JCV im Urin und 69% der Patienten mit positiver JCV-PCR im Urin hatten kein nachweisbares JCV-TEM. JCV-Harnausscheidung ohne nachweisbares JCV-TEM wurde auch bei gesunden Spendern beobachtet (Abb. 2E)., Dies legt nahe, dass das Vorhandensein einer JCV-Replikation in der Niere nicht notwendigerweise zu einem nachweisbaren JCV-TEM im Blut führt. Umgekehrt erhöht dies die Möglichkeit, dass der JCV-TEM-Nachweis im Blut die laufende extrarenale JCV-Replikation widerspiegeln kann.

In einer Studie mit einem neuartigen JCV-Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) – Verfahren (17) betrug die geschätzte Seroprävalenz von JCV bei mit Natalizumab behandelten MS-Patienten 53,6% (17). Die Seropositivität korreliert nicht notwendigerweise mit dem Vorhandensein von TEM-Reaktionen, die mit der Virusreaktivierung zusammenhängen., Langlebige Plasmazellen können über lange Zeiträume, möglicherweise über Jahrzehnte, im Knochenmark verbleiben und anhaltende Serumantikörpertiter ohne aktive Pathogenreplikation aufrechterhalten (18, 19). Wir verwendeten die gleiche ELISA-Methode, um 56 unserer mit Natalizumab behandelten MS-Patienten zu testen, die von JCV ELISPOT getestet worden waren, einschließlich der 2 PML-Patienten. Wie in Abb. 2F, 53,6% der Patienten waren seropositiv und 16,1% waren ELISPOT positiv. Siebenundzwanzig Prozent der JCV-seropositiven Patienten hatten nachweisbares JCV-TEM in ihrem Blut. Nur ein Patient, der JCV ELISPOT positiv war, war seronegativ., Nach Gorelik et al. die falsch-negativ-rate der JCV serologic assay beträgt 2,5% (17).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Häufigkeit des Nachweises von JCV-TEM-Reaktionen bei MS-Patienten mit der Zeit unter Natalizumab zunimmt. Eine frühere Studie zeigte auch einen Anstieg der T-Zell-Reaktionen auf JCV nach 12 Monaten Natalizumab-Therapie, aber diese Studie war auf 18 Monate Behandlung beschränkt (20), während wir fanden, dass der stärkste Anstieg der Effektor – T-Zell-Reaktionen nach 24 Monaten auftrat.,

Unsere Ergebnisse deuten somit auf eine JCV-Reaktivierung während der Natalizumab-Therapie hin, auch an extrarenalen Stellen. JCV wurde im Gehirn von HIV-seronegativen Personen ohne PML nachgewiesen (21). Die verminderte ZNS-Immunüberwachung, die durch Natalizumab induziert wird, könnte die lokale Virusreaktivierung begünstigen, die als asymptomatische intermittierende Virusreplikation beginnen kann, sich aber zu einer anhaltenden Virusreplikation und dann zu PML entwickeln könnte. Die Virusreaktivierung könnte periphere spezifische T-Lymphozyten über Antigen-präsentierende Zellen an Orten wie Gehirn-drainierenden zervikalen Lymphknoten aktivieren (22-24)., Da Natalizumab auf den VLA-4-Rezeptor abzielt, können diese spezifischen Zellen die Blut-Hirn-Schranke nicht effizient überqueren und können sich so im Blut ansammeln, was ihre Erkennung erleichtert. PML ist auch eine Komplikation einer HIV-Infektion im Spätstadium. Ob der Nachweis von JCV-spezifischen Effektor-CD4-und CD8-T-Zellen AIDS-assoziierten PML vorausgehen kann, ist ein Punkt von Interesse, der weitere Untersuchungen verdient. AIDS-assoziierte PML unterscheidet sich jedoch deutlich von Natalizumab-induzierter PML., Die meisten HIV-infizierten Patienten, die PML entwickeln, haben eine tiefe CD4-Lymphopenie, die auch die CD8-T-Zellfunktionalität durch den Mangel an CD4-Hilfe verändert (25). Darüber hinaus gibt es im Gegensatz zu Patienten mit Natalizumab keine Blockade des T-Zellhandels durch die Blut-Hirn-Schranke, und dies kann eine JCV-spezifische TEM-Akkumulation im Blut verhindern.

Zusammen legen unsere Ergebnisse nahe, dass funktionelle Assays, die JCV-spezifische TEM-Reaktionen nachweisen können, dazu beitragen können, Patienten zu identifizieren, bei denen das Risiko besteht, während der Behandlung mit Antikörpern, die den Lymphozytenhandel durch die Blut-Hirn-Schranke hemmen, PML zu entwickeln.,