Abstract
Trichomonas vaginalis, eine Geißel Protozoen, ist der Erreger der trichomonosis, die häufigste virale sexuell übertragbare Erkrankung weltweit. Unter Berücksichtigung der erhöhten Prävalenz von Metronidazol-resistenten Isolaten sind alternative Medikamente für die erfolgreiche Behandlung unerlässlich. Natürliche Produkte sind die Quelle der meisten neuen Medikamente, und die Volksweisheit über die Verwendung von Heilpflanzen ist ein mächtiges Werkzeug bei dieser Suche., In dieser Studie wurde die Aktivität von 10 Heilpflanzen, die von der Mbyá-Guarani indigenen Gruppe im täglichen Leben ausgiebig verwendet wurden, gegen sieben verschiedene T. vaginalis-Isolate bewertet. Unter den getesteten wässrigen Extrakten Verbena sp. (Guachu ka ‚ a in der Mbyá-Guaraní-Sprache) und Campomanesia xanthocarpa (Guavira in Mbyá-Guaraní-Sprache) zeigte die höchste Aktivität gegen T. vaginalis mit MIC-Wert von 4,0 mg/mL zu erreichen 100% Wirksamkeit gegen die Parasiten. Die kinetischen Wachstumstests zeigten, dass die Extrakte nach 4 h Inkubation die vollständige Wachstumsabschaffung förderten., Darüber hinaus förderten die getesteten Extrakte keine signifikante hämolytische Aktivität gegen menschliche Erythrozyten. Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten Mal die potentielle Aktivität von Verbena sp. und C. xanthocarpa gegen T. vaginalis. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass indigenes Wissen eine wichtige Quelle für neue Prototypen von Antiprotozoen ist.
1. Einführung
Trichomonas vaginalis parasitiert den urogenitalen menschlichen Trakt und verursacht Trichomonose, die weltweit häufigste nicht-virale sexuell übertragbare Krankheit, die für 248 Millionen neue Fälle jährlich verantwortlich ist ., Nach der Kolonisation verursacht der Parasit Vaginitis, Urethritis und Prostatitis . Darüber hinaus wurde der Erreger mit schwerwiegenden Folgen wie nachteiligen Schwangerschaftsergebnissen und Frühgeburten , Unfruchtbarkeit , Prädisposition für Gebärmutterhalskrebs und entzündlichen Erkrankungen des Beckens in Verbindung gebracht . Wichtig ist, dass Trichomonose als Cofaktor bei der Übertragung und dem Erwerb des humanen Immunschwächevirus (HIV) wirkt . Trotz der Auswirkungen dieser Infektion ist das therapeutische Arsenal eingeschränkt, und nur Metronidazol und Tinidazol, beide 5-Nitroimidazol-Medikamente, sind von der FDA für die Trichomonosebehandlung zugelassen ., Obwohl die Heilungsrate hoch ist, kann ein Behandlungsversagen beobachtet werden, und die Resistenz von T. vaginalis-Isolaten ist der Hauptgrund für ein Behandlungsversagen . In diesem Sinne ist es zweifellos notwendig, dass die Untersuchung nach neuen Alternativen zur Behandlung von Trichomonose und zwei Strategien verfolgt werden kann: (i) die Suche nach neuen therapeutischen Zielen, die für die rationale Entwicklung neuer Antiparasitika unerlässlich sind, und (ii) die Untersuchung neuer Anti-T., vaginalis-Verbindungen unterscheiden sich strukturell von 5-Nitroimidazolen und wirken folglich durch einen anderen Mechanismus, wie unsere Gruppe zeigt .
Naturprodukte, insbesondere Heilpflanzen, sind in diesem Zusammenhang als potente Quelle bioaktiver Moleküle unermesslich. Seit der Antike verwenden Menschen Pflanzen, um häufige Infektionskrankheiten zu behandeln, und einige dieser traditionellen Medikamente sind immer noch als Teil der Heilung verschiedener Pathologien integriert . Darüber hinaus rettet die auf ethnopharmakologischen Informationen basierende Suche das immense empirische Wissen über die Pflanzennutzung ., In diesem Zusammenhang ist Brasilien in Bezug auf die natürliche Umwelt und den enormen Reichtum an genetischen Ressourcen ein Land von großem Interesse für die Ethnopharmakologie .
Indigene Völker verfügen über eine Fülle von Biodiversitätsinformationen und wissen, wie sie natürliche Ressourcen erfassen und nutzen können . Trotz der Tatsache, dass mehrere Drogen durch traditionelle Heilmittel und Volkswissen entdeckt wurden, gibt es in Brasilien 122 indigene ethnische Gruppen, von denen jedoch nur 30% in Bezug auf ethnobotanische Aspekte untersucht wurden ., Daher ist das Studium von Pflanzen, die von der indigenen Medizin verwendet werden, wichtig, um die traditionelle Medizin und die biotische Umwelt unter Beibehaltung des uralten indigenen Wissens zu verbinden.
Parasitäre Protozoen sind nach wie vor eine große Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier, und es gibt nur wenige wirksame Medikamente zur Behandlung vieler Protozoenerkrankungen. Unter Berücksichtigung der indigenen Ethnopharmakologie als Beitrag zum systematischen Screening von Pflanzen mit antiprotozoaler Aktivität bewertete diese Studie das Anti-T., vaginalis Aktivität der wichtigsten Heilpflanzen in Mbyá-Guarani indigene Medizin im Süden Brasiliens verwendet.
2. Materialien und Methoden
2.1. Parasitenkulturbedingungen
In dieser Studie sieben Isolate von T., vaginalis verwendet wurden: 30236 und 30238 von der American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2 und TV-LACM3 (frische klinische Isolate von Patientinnen); TV-LACH1 und TV-LACH2 (frische klinische Isolate von männlichen Patienten) alle von Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brasilien (Projekt mit ethischer Genehmigung durch UFRGS Ethische Research Committee, Anzahl 18923). Trichomonaden wurden axenisch in Trypticase-Hefe-Extrakt-Maltose (TYM) Medium (pH 6.0) kultiviert, mit 10% hitzeinaktiviertem Rinderserum ergänzt und bei 37°C inkubiert .
2.2., Pflanzenmaterial
Pflanzenmaterial wurde im März 2011 vom indigenen Stamm Mbyá-Guarani im Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brasilien (30°06’47.62″ S und 51°07’37.85″ W) gesammelt. Dieses Dorf heißt Tekoá Anhetenguá (auf Englisch, Wahres Dorf), und 200 Menschen leben in der Gegend, die bei 40 Familien versammelt sind. Die Frauen des Dorfes haben das Wissen über Heilpflanzen, die von der gesamten Bevölkerung verwendet werden, und führten die Sammlung von Exemplaren durch. Zehn Pflanzen, die routinemäßig in der einheimischen Medizin für Infektionskrankheiten verwendet wurden, wurden gesammelt: Blätter von Aloe Arborescens Mill., (ICN 173371), Luftteile von Bidens pilosa L. (ICN 167397), Luftteile von Rhipsalis baccifera (ICN 167402), Barks von Luehea divaricata (ICN 167403), Wurzeln von Trichilia sp. (ICN 173126), Blätter von Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), Blätter von Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), Blätter von Citrus Limonium (ICN 167399), Blätter von Citrus reticulata (ICN 173127) und Blätter von Verbena sp. (ICN 167394). Der Gutschein Proben wurden hinterlegt im herbarium der Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN).
2.3., Zubereitung von Pflanzenextrakten
Die frischen Pflanzenextrakte wurden gemäß traditioneller Verwendung durch Ureinwohner durch Abkochung bei 60°C für 60 min hergestellt . Wässrige Extrakte wurden gefriergetrocknet, und die Arbeitslösung wurde bei 8,0 mg/ml in Reinstwasser hergestellt, durch Filtration sterilisiert (0,22 µm) und bei -20°C gelagert.
2.4. Anti-Trichomonas vaginalis Assay
Zehn wässrige Extrakte wurden in vitro auf Aktivität gegen T. vaginalis untersucht. Der Assay wurde in 96 Mikrotiterplatten bei einer Endkonzentration von 4,0 mg/ml in den Vertiefungen durchgeführt., Die inhibitorische Mindestkonzentration (MIC) wurde unter Verwendung einer achtfachen Verdünnung (4,0–0,031 mg/ml) bestimmt, und die Lebensfähigkeit der Trophozoiten wurde nach einer fluorimetrischen Methode bestimmt . Zwei Kontrollen wurden durchgeführt: negative Kontrolle nur mit Trophozoiten und eine positive Kontrolle mit 8.0 µM Metronidazol(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Die Experimente wurden mindestens in drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der lebensfähigen Trophozoiten im Vergleich zu unbehandelten Parasiten ausgedrückt.
2.5., Wachstumseffekt wässriger Extrakte
Um die Wirkung der aktiven wässrigen Extrakte auf das Wachstum von T. vaginalis zu untersuchen, wurde eine kinetische Wachstumskurve unter Verwendung des ATCC 30236-Isolats durchgeführt. Die Anfangsdichte der Parasiten von 2,0 × 105 Trophozoiten / ml wurde mit den Extrakten bei MIC-Wert im TYM-Medium inkubiert. Die Trophozoiten wurden mit einem Hämozytometer während 72 h gezählt.Die Ergebnisse wurden als Trophozoitenzahl (105/ml) ausgedrückt., Für die mikroskopische Analyse wurden die Kontrollen und behandelten Parasiten für 10 min bei 2.000 U / min zentrifugiert, um die Organismen nach 4 h Inkubation zu konzentrieren, und das Präparat wurde im Lichtmikroskop (vergrößert ×1.000) durch Trypan-Blaufarbstoffausschluss beobachtet.
2.6. Hämolytischer Assay
Dieser Assay wurde nach der von Rocha et al. . Blutgruppe O positiv von gesunden menschlichen Freiwilligen wurde mit Alsever-Lösung (1 : 1) gesammelt und bei 2.000 U / min für 5 min zentrifugiert. Die Erythrozytenfraktion wurde dreimal mit PBS 1x (pH 7.,0) und resuspendiert, um 1% rote Zellsuspension (v/v) zu ergeben. Die Konzentrationen wässriger Extrakte wurden entsprechend der im Suszeptibilitätstest ermittelten minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) ausgewählt. Die Erythrozyten wurden mit den Extrakten bei 37°C unter Rühren für 1 h inkubiert und dann bei 3.000 U / min für 5 min zentrifugiert. Die Absorption des Überstands wurde bei 540 nm gemessen. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt, und der Prozentsatz der Hämolyse, der durch jede getestete Probe verursacht wurde, wurde im Vergleich zu 100% hämolytischer Aktivität von Saponin aus Quillaja Saponaria berechnet .
3., Ergebnisse und Diskussion
Diese Studie untersuchte die Anti-T. vaginalis-Aktivität von wässrigen Extrakten von 10 Heilpflanzen, die im Medizinsystem Mbyá-Guarani verwendet werden. Wichtig ist, dass wir unter den getesteten Pflanzen zwei wässrige Extrakte mit einer starken Anti-T. vaginalis-In-vitro-Aktivität gefunden haben. Die vielversprechenden Extrakte sind von Verbena sp. und Campomanesia xanthocarpa. Der Auszug aus Verbena sp. bei 4,0 mg/mL zeigten die optimale anti-T. vaginalis-Aktivität induzieren komplette Zytotoxizität (100% der Parasiten Tod) auf alle unterschiedlichen trichomonads Isolate (Abbildung 1(a))., Der Blattextrakt von Campomanesia xanthocarpa in der gleichen Konzentration zeigte auch eine sehr hohe Anti-T. vaginalis-Aktivität, wodurch die Lebensfähigkeit des Parasiten um bis zu 96% verringert wurde(Abbildung 1 (b)).
Andere wässrige Extrakte zeigten eine Vielzahl von Ergebnissen. Der wässrige Extrakt aus Bidens pilosa hat die Lebensfähigkeit der Trophozoiten nur des 30236-Isolats vollständig abgeschafft(Abbildung 1 (c)). Der Extrakt aus den Bellen von Luehea divaricata induzierte eine Verringerung der Lebensfähigkeit von T. vaginalis in jedem getesteten Trichomonadenisolat unterschiedlich (Abbildung 1 (d))., Die Wirkung von Coix lacryma-jobi induzierte im Durchschnitt 75% der Lebensfähigkeitsreduktion auf T. vaginalis-Isolate; Für das TV-LACH2-Isolat betrug die Reduktion jedoch nur 40% (Abbildung 1 (e)). Die frischen klinischen Isolate von männlichen Patienten (TV-LACH1 und TV-LACH2) zeigten eine höhere Anfälligkeit als die Isolate von weiblichen Patienten (ATCC und fresh clinical), wenn der Wurzelextrakt von Trichilia sp. wurde getestet (Abbildung 1 (f)). Extrakte von Blättern aus Citrus Limonium reduziert etwa 40% die Lebensfähigkeit von Isolaten(Abbildung 1 (g))., Die Extrakte aus Aloe Arborescens und Citrus reticulata verringerten die Lebensfähigkeit von mindestens einem Isolat um 50% (Abbildungen 1(h) und 1 (i)), während Rhipsalis baccifera die Lebensfähigkeit von 30236-und TV-LACM2-Isolaten nur um 30% verringerte(Abbildung 1 (j)).
Im Vergleich zu den anderen Extrakten sind die Extrakte aus Verbena sp. und C. xanthocarpa zeigte die vielversprechendste Aktivität gegen T. vaginalis, und die minimale inhibitorische Konzentration wurde für das 30236-Isolat bestimmt (Tabelle 1).,
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Um die Wirkung des aktivsten Extrakts auf das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Parasiten zu untersuchen, wurde eine kinetische Wachstumskurve durchgeführt. Die Kontrolle zeigte den klassischen Wachstumsspitzenwert nach 24 h Inkubation; jedoch behandelten die Organismen mit Extrakten von Verbena sp. und C., xanthocarpa rief nach 4 h Inkubation eine vollständige Wachstumsabschaffung hervor (Abbildung 2) und zeigte eine charakteristische blaue Farbe durch trypanblauen Farbstoffausschluss, der den Zelltod anzeigt (Abbildung 3).
Kinetische Wachstumskurve von Trichomonas vaginalis 30236 nach Behandlung mit wässrigen Extrakten von Verbena sp isolieren. und Campomanesia xanthocarpa bei 4,0 mg / ml. Das Wachstum der Trophozoiten wurde durch die Extrakte in 4 Stunden Inkubation vollständig gehemmt., Data represent means ± standard deviation of at least three experiments, all in triplicate.
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(c) Campomanesia xanthocarpa
Mikroskopische Analyse der Parasitenmorphologie im Lichtmikroskop (vergrößert ×1.000) durch trypan blue dye Ausschluss. (a) Kontrolle; (b) nach 4 Stunden Behandlung mit wässrigem Extrakt von Verbena sp.; (c) nach 4 Stunden Behandlung mit wässrigem Extrakt aus Campomanesia xanthocarpa.
Um eine mögliche Wirkung der C. xanthocarpa und Verbena sp zu untersuchen., extrakte auf Parasitenmembran und auch um vorläufige Daten zur Zytotoxizität gegen Säugetierzellen zu erhalten, wurde eine hämolytische Aktivität dieser Extrakte durchgeführt. Die Eisenkraut sp. und C. Xanthocarpa-Extrakte wurden bei MIC-Werten getestet und zeigten 6,5 bzw. 7,6% Erythrozytenlyse (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigten, dass beide Extrakte bei MIC-Werten keine signifikante hämolytische Aktivität förderten, was darauf hindeutet, dass der Wirkmechanismus, der für die Verringerung der Lebensfähigkeit des Parasiten verantwortlich ist, wahrscheinlich keine Störung der parasitären Membran mit sich bringt., Darüber hinaus und vor allem deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass beide Extrakte für Säugetierzellen nicht toxisch sind, da sie menschliche Erythrozyten nicht lyse.
Diese Studie trägt zur Rettung des indigenen Wissens über Heilpflanzen bei. Die einheimischen Mbyá-Guarani verwenden Verbena sp. (Guachu ka ‚ a in Mbyá-Guarani-Sprache), als Tee zur Linderung von Symptomen von Infektionskrankheiten wie Fieber. Dies ist in Übereinstimmung mit der Literatur, die Verbena sp bezieht. infusion als Beruhigungsmittel, schmerzlindernd bei entzündlichen Erkrankungen, Hautverbrennungen, Amenorrhoe, Depressionen und Magenerkrankungen ., Darüber hinaus hat diese Art eine Vielzahl von chemischen Bestandteilen, wie Flavonoid, Iridoidglykoside, Phenylpropanoidglykosid, Sterole, Triterpene und Glykokonjugat, und die biologische Aktivität kann ihnen teilweise zugeschrieben werden . Darüber hinaus verwendet dieser Stamm die Blätter von C. xanthocarpa (Guavira in Mbyá-Guarani-Sprache) zur Behandlung von Durchfall, Magenschmerzen und Würmern., Diese Pflanze wird traditionell im Süden Brasiliens als Entschlackungsmittel, Antidiarrhoe, Reinigungsmittel und Antirheumatikum sowie zur Senkung des Cholesterinspiegels im Blut verwendet, und diese Eigenschaften können Tanninen, Saponinen und Flavonoiden (Quercetin , Myricetin, Quercitrin und Rutin) zugeschrieben werden Rutin), Verbindungen in den Blättern von C. xanthocarpa .
Die historische Ethnopharmakologie historischer Nutzungen von Pflanzen gilt als wertvoll für die Bioprospektion, da sie die Gründe für die Auswahl und Erforschung von Heilpflanzen liefert ., Diese Studie beschreibt den ersten Bericht über die antiprotozoale Aktivität von Verbena sp. und C. xanthocarpa. Darüber hinaus wurden andere Arten der Familien Verbenaceae und Myrtaceae jedoch erfolglos gegen T. vaginalis getestet . Mehrere Biodiversitäten und traditionelles Wissen über verschiedene Populationen haben Studien geleitet, um nach neuen Prototypen zu suchen Anti-T. vaginalis. Kürzlich wurde über das Potenzial von Pflanzen berichtet, die traditionell aus Caatinga gegen T. vaginalis verwendet werden . Calzada et al., gezeigt, dass Pflanzen, die in der mexikanischen traditionellen Medizin für Erkrankungen des Urogenitaltrakts verwendet wurden, eine Wirkung gegen dieses Protozoen zeigten. Amaryllidaceae-Arten, die in Südafrika gegen Geschlechtskrankheiten eingesetzt wurden, zeigten ebenfalls vielversprechende Aktivität gegen T. vaginalis .
In Anbetracht der Auswirkungen der Trichomonose auf die öffentliche Gesundheit und der aufkommenden Anzahl resistenter T. vaginalis-Isolate sind Alternativen zur Behandlung dieser Infektion erforderlich. Natürliche Produkte sind eine vielversprechende Quelle aktiver Moleküle, und der ethnopharmakologische Ansatz rettet das Wissen über die Population von Heilpflanzen., Diese Weisheit in Kombination mit chemischen und pharmakologischen Studien stellt einen wertvollen Wert in der Bioprospektion innovativer, sicherer und zugänglicher Medikamente dar. Diese Pionierstudie zeigte relevante Ergebnisse zur Anti-T. vaginalis-Aktivität der Verbena sp. und C. xanthocarpa, Pflanzen, die traditionell von der indigenen Bevölkerung Mbyá-Guarani für Infektionskrankheiten verwendet werden. Trotz der starken Anti-T. Vaginalis-Aktivität rettete dieser Bericht das Wissen der Ureinwohner und vermeidete die Fehlgeburt dieser Weisheit.,
Beitrag der Autoren
Clara Lia Costa Brandelli und Patrícia de Brum Vieira trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.
Quittungen
Diese Arbeit wurde vom NANOBIOTEC-Brazil Programm von CAPES und FAPERGS unterstützt. Die Autoren danken dem Häuptling José Cirilo Pires Morinico (Stamm Mbyá-Guarani) für die Durchführung dieser Studie und für die wertvollen Informationen. Alexandre José Macedo und Tiana Tasca danken CNPq für Forschungsstipendien.
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