A Beginner ‚ s Guide to Next Generation Sequencing (NGS) – Technologie

Der Abschluss des Human Genome Project im Jahr 2003 begann eine neue ära der schnelle, erschwingliche und genaue Genom—Analyse-namens Next Generation Sequencing (NGS). NGS baut auf Sequenzierungstechnologien der ersten Generation auf, um genaue und kostengünstige Sequenzierergebnisse zu erzielen.

Fred Sanger sequenzierte das erste ganze DNA-Genom, den Virus-Phagen ?X174, 1977., Im selben Jahr entwickelte Sanger das zukünftige Rückgrat der Genom-Ära: die DNA-Sequenzierungstechnologie. Seine Technik verwendete die Kettenabschlussmethode. Dies wird jetzt als die „Technologie der ersten Generation“ der Genomsequenzierung angesehen.

Da die Sanger-Sequenzierung (oder die Kettenabschlussmethode) die erste Generation der Sequenzierungstechnologie ist, ist es sehr wichtig, sie zu verstehen. Das Humangenomprojekt begann mit der Sanger-Sequenzierungstechnologie.,

Die Sanger-Sequenzierungsmethode

Die Sanger-Sequenzierungsmethode stützt sich auf Dideoxynukleotide (ddNTPs),eine Art von Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs), denen eine 3′ Hydroxylgruppe fehlt und stattdessen ein Wasserstoffatom aufweist . Wenn diese Basen an die wachsende DNA-Sequenz binden, beenden sie die Replikation, da sie andere Basen nicht binden können. Um die Sanger-Sequenzierung durchzuführen, fügen Sie Ihre Primer einer Lösung hinzu, die die zu sequenzierende genetische Information enthält, und teilen die Lösung dann in vier PCR-Reaktionen auf., Jede Reaktion enthält eine mit dNTP-Mischung mit einem der vier Nukleotide, die durch eine ddNTP-Gruppe (A -, T -, G-und C-ddNTP-Gruppe) substituiert sind. Am Ende der PCR liefert jede Ihrer vier Reaktionen PCR-Produkte unterschiedlicher Länge, da die Replikation zufällig beendet wird. Wenn Sie die Proben auf einem Gel mit 4 Spuren ausführen, können Sie die Sequenz zusammenfügen, da jede Sequenz aus demselben Originalmaterial repliziert wurde. Hier ist ein Beispiel, in dem die ddNTPs fett gedruckt sind und die dNTPs nicht:

Ihre Sequenz ist ATGCTCAG.,

Ihre vier Reaktionen geben Ihnen:
Reaktion mit ddATP: A, ATGCTCA, ATGCTCAG
Reaktion mit ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reaktion mit ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reaktion mit ddTTP: AT, ATGCT, ATGCTCAGC

Alle Reaktionen, die einmal ein Gel ausführen, würden ungefähr so aussehen (Bild von Olwen Reina):

Jedes band bezeichnet die verschiedenen längen code. Zum Beispiel ist das Band rechts unter dem „A“ symbolisiert die Sequenz: „ATGCTCA“

Noch verwirrt?

Stellen wir uns ein Partyspiel vor. Das Spiel ist ein Ratespiel., So wird es gespielt:

Sie denken an eine Zahl und die Gruppe muss sie erraten. Der schwierige Teil ist, dass die Zahl 200-stellig ist. Sie lesen die Ziffern der Zahl in Ihrem Kopf, ohne ein Geräusch zu machen. Hin und wieder unterbricht eine Person Sie, und Sie sagen ihnen, welche einzelne Ziffer Sie gerade gedacht haben und wo sie sich in der Reihenfolge von 200 befindet. Jedes Mal, wenn Sie unterbrochen werden, müssen Sie erneut beginnen. Sie verlassen nach ein paar Stunden und die Gruppe muss die 200-stellige Nummer herausfinden., Sie müssen die Informationen zusammenfügen, die Sie ihnen gegeben haben,zum Beispiel war die 25. Anhand der Informationen aus ihren Unterbrechungen können sie die Nummer wiederholen, die sie Ihnen gegeben haben.

Während dies wie das lahmste Spiel der Welt klingt, funktioniert es sehr gut für die Sequenzierung!

Leider ist es langsam, teuer und (bisher) auf radioaktive Materialien angewiesen. Dies drängte die Wissenschaftler, neue und bessere Formen der Genomsequenzierung zu entwickeln.,

Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation

Die größten Fortschritte bei der Genomsequenzierung waren die Erhöhung der Geschwindigkeit und Genauigkeit, was zu einer Reduzierung von Arbeitskräften und Kosten führte. Die Geschwindigkeit ist dank paralleler Analyse und hoher Durchsatztechnologie. Es ist der Unterschied zwischen einem 4-Jährigen, Moby Dick zu lesen und einem Haufen Drama-Majors jeweils einen Absatz zu geben und sie zu bitten, sofort zu lesen.

Sequenziermaschinen haben sich seit der Entwicklung seiner Methode stark verbessert., 1987 führte Applied Biosystems als erstes eine automatische Sequenziermaschine namens AB370 ein. Die Maschine stützte sich auf eine Methode namens Kapillarelektrophorese, die Sangers Kettenabschlussmethode verwendete, ohne ein Gel zu benötigen.

Fluoreszenzmarkierte kettenende ddNTPs werden dem PCR-Reaktionsmisch zugesetzt. Durch die Sanger-Sequenzierungsmethode werden PCR-Produkte unterschiedlicher Länge erstellt und dann entsprechend ihrer Größe getrennt. Die Größe wird anhand der gesamten negativen Ladung des PCR-Produkts gemessen. Je negativer die Ladung, desto länger das Fragment., Nehmen Sie das obige Beispiel der ddNTP-Integration und stellen Sie sich vor,dass die fett gedruckten Buchstaben ddNTPs mit einem Fluorochrom sind. Wenn die Fragmente in Richtung der positiven Elektrode einer Kapillare gezogen werden (siehe Bild unten), passieren sie einen Laserstrahl, der einen Lichtblitz von dem an das ddNTP angeschlossenen Fluorochrom auslöst, der für den Basistyp charakteristisch ist (z. B. grün für A, gelb für T, blau für G, rot für C). Auf diese Weise wird das Genom sorgfältig gelesen.

Der größte Unterschied war hier der Geschwindigkeit und der Kosten., AB370 konnte 96 Basen gleichzeitig erkennen, 500K Basen pro Tag, und hatte eine Leselänge von 600 Basen, indem eine parallele Analyse und ein Setup mit hohem Durchsatz verwendet wurden. Diese Form der Sequenzierung wurde zum Hauptinstrument für den Abschluss des Humangenomprojekts.

Wie vergleicht sich NGS mit Sequenzierung der ersten Generation?

NGS zeichnet sich durch verbesserte Genauigkeit und Geschwindigkeit, aber auch reduzierte Arbeitskräfte und Kosten aus. Es gab noch nie eine Zeit, in der es so billig, bequem oder einfach war, ein Genom zu sequenzieren., Die wohl größte Verbesserung war die Entwicklung der parallelen Analyse, die die Sequenzierungsgeschwindigkeit erhöhte.

Das einzige, was uns jetzt verlangsamt, ist die Interpretation der Ergebnisse!