7.13 F: DNA-Sequenzierung Basiert auf der Sanger-Dideoxynucleotides

die Sanger-Sequenzierung, auch bekannt als “ chain-termination-sequencing, bezieht sich auf eine Methode der DNA-Sequenzierung entwickelt von Frederick Sanger in 1977. Diese Methode basiert auf der Amplifikation des DNA-Fragments, das durch DNA-Polymerase sequenziert werden soll, und dem Einbau modifizierter Nukleotide – insbesondere Dideoxynukleotide (ddNTPs).,

Die klassische Kettenbeendigungsmethode erfordert eine einzelsträngige DNA-Schablone, einen DNA-Primer, eine DNA-Polymerase, normale Desoxynukleotidetriphosphate (dNTPs) und modifizierte Nukleotide (dideoxyNTPs), die die DNA-Strangverlängerung beenden. Diese Kettenabschlussnukleotide haben keine 3 ‚ – OH-Gruppe, die für die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei Nukleotiden erforderlich ist, wodurch die DNA-Polymerase die DNA-Erweiterung aufhört, wenn ein ddNTP eingebaut wird. Die ddNTPs können zur Detektion in automatisierten Sequenziermaschinen radioaktiv oder fluoreszierend gekennzeichnet werden.,Die DNA-Probe ist in vier separate Sequenzierreaktionen unterteilt, die alle vier der Standard-Desoxynukleotide (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) und die DNA-Polymerase enthalten. Zu jeder Reaktion wird nur eines der vier Dideoxynukleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP oder ddTTP) hinzugefügt. Nach Runden der Schablonen-DNA-Verlängerung aus dem gebundenen Primer werden die resultierenden DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese wärme denaturiert und nach Größe getrennt. Dies wird häufig unter Verwendung eines denaturierenden Polyacrylamid-Harnstoff-Gels durchgeführt, wobei jede der vier Reaktionen in einer von vier einzelnen Bahnen (Bahnen A, T, G, C) abläuft., Die DNA-Bänder können dann durch Autoradiographie oder UV-Licht visualisiert werden und die DNA-Sequenz kann direkt aus dem Röntgenfilm oder Gelbild abgelesen werden.

Technische Variationen der Kettenabschlusssequenzierung umfassen das Markieren mit Nukleotiden, die radioaktiven Phosphor zur radioaktiven Markierung enthalten, oder die Verwendung eines Primers, der am 5′-Ende mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Die Farbstoff-Primer-Sequenzierung erleichtert das Einlesen in ein optisches System für eine schnellere und wirtschaftlichere Analyse und Automatisierung. Die spätere Entwicklung von fluoreszenzmarkierten ddNTPs und Primern durch Leroy Hood und Mitarbeiter setzte die Weichen für eine automatisierte DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Kettenbeendigungsmethoden haben die DNA-Sequenzierung stark vereinfacht., In jüngerer Zeit wurde die Farbstoff-Terminator-Sequenzierung entwickelt. Die Farbstoff-Terminator-Sequenzierung verwendet die Etikettierung des Kettenterminators ddNTPs, was die Sequenzierung in einer einzigen Reaktion anstelle von vier Reaktionen wie bei der etikettierten Primer-Methode ermöglicht. Bei der Farbstoff-Terminator-Sequenzierung ist jeder der vier Dideoxynukleotid-Kettenterminatoren mit fluoreszierenden Farbstoffen gekennzeichnet, die jeweils Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen emittieren.,

Automatisierte DNA-Sequenzierungsinstrumente (DNA-Sequenzer) können bis zu 384 DNA-Proben in einer einzigen Charge (Ausführung) in bis zu 24 Durchläufen pro Tag sequenzieren., DNA-Sequenzer führen Kapillarelektrophorese zur Größentrennung, Erkennung und Aufzeichnung von Farbstofffluoreszenz und Datenausgabe als fluoreszierende Peak-Spurenchromatogramme durch. Die Automatisierung hat zur Sequenzierung ganzer Genome geführt.