PMC (Dansk)

TEKST

Natalizumab, et antistof, der anvendes til behandling af attakvis multipel sclerose (MS), forhindrer trafficking af aktiverede lymfocytter, herunder autoreactive lymfocytter, gennem blod-hjerne-barrieren (BBB). Den væsentligste skadelige effekt af natalizumab er progressiv multifokal leukoencefalopati (PML), en ødelæggende demyeliniserende sygdom forårsaget af replikation af menneskelige JC polyomavirus (JCV) i oligodendrocytes og astrocytes (1, 2)., Natali .umab-hæmning af effektor-T-cellehandel fra blod til centralnervesystemet (CNS) kan favorisere lokal JCV-replikation (3-7).

Her undersøgte vi tilstedeværelsen af JCV-specifikke effektorhukommelse T-celler (TEM) i blod fra MS-patienter efter antigenaktivering natten over e.vivo. In vivo falder specifikke TEM-tal, når det kognerede antigen er ryddet (8-10), og deres tilstedeværelse kan således pege på igangværende JCV-replikation. Tem frigiver hurtigt cytokiner, såsom gamma interferon (IFN-γ), når de udsættes for antigen igen., En tidligere en .ymbundet immunosorbent spot assay (ELISPOT) undersøgte IFN-y-ekspression i T-celler efter langvarig aktivering med JCV-peptider i op til 14 dage (11). Langvarig aktivering gør det imidlertid muligt at genaktivere langvarig hvilende t-cellehukommelse og udvide, hvilket betyder, at en positiv respons ikke nødvendigvis betyder et igangværende immunrespons. Her undersøgte vi først tilstedeværelsen af JCV-specifik TEM hos to MS-patienter, der udviklede PML. Den første patient blev diagnosticeret med PML efter 39 måneder på natalizumab (39 infusioner) (Department of Neurology, Pitié-Salpétrière Hospital)., Hun var 39 år gammel og havde en 10-årig historie med recidiverende remitterende MS. før Natali .umab havde hun modtaget cyclophosphamid og Mito .antron. PML blev bekræftet af MR og JCV PCR på cerebrospinalvæske (CSF). Da hun blev testet for JCV-specifik TEM, 8 uger efter PML-symptomdebut, havde hun 1.040 JCV-genomkopier pr. ml CSF (JCV Alert-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Hendes perifere blod mononukleære celler (PBMC) blev aktiveret in vitro i MÅL-V og Albumax medium (Invitrogen) i 16 timer med renset JCV (stamme MAD-4; LGC Promochem; 104.5 50% vævskultur smitsom dosis /0,2 ml)., Der blev ikke tilsat rekombinant interleukin 2 (IL-2). En mængde virus svarende til 5,534 PFU blev tilsat til hver brønd. Dette svarede til en mangfoldighed af infektion (MOI) på 0, 02. Celler blev derefter testet for intracellulær IFN-Y ved Flo .cytometri. Celledødeligheden efter aktivering natten over var mindre end 5%. Som vist i Fig. 1A og andB,B, reagerer cellerne blev påvist i både CD4 og CD8 T-celle-delmængder, og de fleste af dem havde CCR7− CD45RA− fænotype, der er karakteristisk for hukommelse effektorer (12)., Anti-JCV TEM blev også opdaget af IFN-γ ELISPOT (opsamling og påvisning af antistoffer, kloner 1-D1 og K7-B6-1, henholdsvis; Mabtech) efter 16 timer i aktivering med renset JCV-eller VP-1 peptider (en blanding af 14 puljer af overlappende 15-aminosyre, peptider, der dækker hele JCV VP-1-protein ) (Fig. 1C). Den anden patient var 46 år gammel og havde en 11-årige historie af attakvis MS. Før natalizumab, hun havde fået beta-interferon, glatiramer acetat, azathioprin, og mitoxantron. Hun blev henvist til Tenon Hospital MS-center for revurdering efter 24 natalizumab infusioner., En hjerne-MR udført i maj 2012 opdagede en lille, lineær, T2-hyperintense mistænkt læsion i det sidestillede højre frontale område. Den første CSF-prøve var negativ for JCV. Gentag MR efter tilbagetrækning af Natali .umab afslørede en stigning i læsionsstørrelse, hvilket førte til to yderligere CSF-undersøgelser, som begge var negative for JCV. JCV PCR på plasma blev udført 2 og 4 måneder efter starten af PML. Begge plasmaprøver var negative. Hjernebiopsi udført i September 2012 bekræftede endelig diagnosen PML.,

ELISPOT analyse af IFN-γ svar til JCV, udført 2 dage efter sidste natalizumab infusion, viste tilstedeværelsen af JCV-specifikke TEM i blodet (Fig. 1C). Interessant nok var cirkulerende JCV-specifikke TEM-tal lavere end hos den første PML-patient, som måske har haft et højere niveau af JCV-replikation i hjernen, da JCV PCR på CSF var positiv hos den første patient og negativ i den anden.,

Vi også undersøgt for tilstedeværelsen af JCV-specifikke TEM ved ELISPOT i en serie af 62 MS patienter med attakvis MS, der er behandlet med natalizumab i henhold til den Europæiske angår markedsføring, samt i 35 MS-patienter, som ikke modtog nogen sygdomsmodificerende behandling, og en gruppe af 40 sunde donorer matchet for alder og køn med MS-patienter. Karakteristika for MS-patienterne er vist i tabel 1. Patienterne og de sunde donorer gav deres skriftlige samtykke til at deltage i undersøgelsen, som blev godkendt af etikudvalget på Piti.-Salp .tri .re Hospital, Paris., En ELISPOT-respons blev betragtet som positiv, hvis det korrigerede antal pletter (antal pletter i aktiverede brønde minus antal pletter i ubehandlede brønde) var mindst 10, med færre end 10 pletter i ubehandlede brønde.

andelen af positive prøver var 2, 5% hos raske donorer (Fig. 2A). I MS-gruppen steg procentdelen af positive patienter med tiden på Natali .umab (Fig . 2B og andC),C), fra 8,8% i ubehandlet MS-patienter til 15,9% blandt patienter behandlet med natalizumab for mindre end 24 måneder og 27% blandt patienter behandlet i mere end 24 måneder (Fig., 2C) (signifikant for patienter behandlet i mere end 24 måneder versus ubehandlet MS og versus kontrolpersoner). Denne stigning i hyppigheden af påvisning af JCV TEM-responser antydede, at langvarig Natali .umab-behandling favoriserede JCV-reaktivering.

en delmængde af Natali .umab-behandlede patienter blev udtaget mindst to gange (se tabel 1). Som vist i Fig. 2D, blev de fleste af disse patienter enten eller forblev positive i prøveudtagningsperioden.,

nyren er et vigtigt reservoir for JCV. En betydelig procentdel af den generelle befolkning udskiller virussen i deres urin, men har ingen bevis for JCV i deres blod (13-15). Derudover synes tilstedeværelsen af JCV-DNA i hjernen at være uafhængig af dets tilstedeværelse i nyrerne (16). Som vist i Fig. 2E, 60% af MS-patienter med påviselig JCV TEM i blodet havde ingen påviselig JCV i deres urin, og 69% af patienter med positiv JCV PCR i urinen havde ingen påviselig JCV TEM. JCV urinudskillelse uden påviselig JCV TEM blev også observeret hos raske donorer (fig . 2E)., Dette antyder, at tilstedeværelsen af JCV-replikation i nyre ikke nødvendigvis fører til påviselig JCV TEM i blod. Omvendt rejser dette muligheden for, at JCV TEM-detektion i blod kan afspejle igangværende e .trarenal JCV-replikation.

I en undersøgelse, der ved hjælp af en roman JCV enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metode (17), den anslåede seroprævalens af JCV i MS-patienter behandlet med natalizumab var 53.6% (17). Seropositivitet korrelerer ikke nødvendigvis med tilstedeværelsen af TEM-responser, som er relateret til virusreaktivering., Langlivede plasmaceller kan fortsætte i knoglemarv i lange tidsperioder, måske i årtier, opretholde vedvarende serumantistoftitere uden aktiv patogenreplikation (18, 19). Vi brugte den samme ELISA metode til at teste 56 af vores natalizumab-behandlet MS-patienter, som var blevet testet ved JCV ELISPOT, herunder 2 PML patienter. Som vist i Fig. 2F, 53, 6% af patienterne var seropositive og 16, 1% var ELISPOT positive. Syvogtyve procent af JCV-seropositive patienter havde detekterbar JCV TEM i deres blod. Kun en patient, der var JCV ELISPOT positiv, var seronegativ., Ifølge Gorelik et al. er den falsk-negative rate af det serologiske JCV-assay 2,5% (17).

vores resultater viser, at hyppigheden af påvisning af JCV TEM-respons hos MS-patienter stiger med tiden på Natali .umab. En tidligere undersøgelse viste også en stigning i T celle responser til JCV efter 12 måneder af natalizumab terapi, men denne undersøgelse var begrænset til 18 måneders behandling (20), der henviser til, at vi fandt, at den største stigning i effektor T-celle responser opstod efter 24 måneder.,

vores resultater peger således på JCV-reaktivering under Natali .umab-behandling, inklusive på ekstrarenale steder. JCV er blevet påvist i hjernen hos HIV-seronegative individer uden PML (21). Den formindskede CNS-immunosurveillance induceret af Natali .umab kan favorisere lokal virusreaktivering, der kan starte som asymptomatisk intermitterende virusreplikation, men kan udvikle sig mod vedvarende virusreplikation og derefter til PML. Virusreaktivering kunne aktivere perifere specifikke T-lymfocytter via antigenpræsenterende celler på steder som hjernedrænkende cervikale lymfeknuder (22-24)., Da Natali .umab er målrettet mod VLA-4-receptoren, kan disse specifikke celler ikke effektivt krydse blod-hjerne-barrieren og kan således ophobes i blod, hvilket letter deres påvisning. PML er også en komplikation af sent stadium HIV-infektion. Hvorvidt detektion af JCV-specifikke effektor CD4 og CD8 T-celler kan gå forud for AIDS-associeret PML er et interessepunkt, der fortjener yderligere undersøgelse. AIDS-associeret PML er imidlertid klart forskellig fra Natali .umab-induceret PML., De fleste HIV-inficerede patienter, der udvikler PML, har dyb CD4-lymfopeni, som også ændrer CD8 T-cellefunktionalitet gennem manglen på CD4-Hjælp (25). Desuden, i modsætning til patienter på natalizumab, der er ingen blokade af T-celle menneskehandel gennem blod-hjerne-barrieren, og dette kan forhindre, JCV-specifikke TEM-ophobning i blodet.

sammen antyder vores resultater, at funktionelle assays, der er i stand til at detektere JCV-specifikke TEM-responser, kan hjælpe med at identificere patienter, der risikerer at udvikle PML under behandling med antistoffer, der hæmmer lymfocythandel gennem blod-hjernebarrieren.,