En Nybegynder ‘ s Guide til Næste Generation Sequencing (NGS) Teknologi

færdiggørelsen af det Humane Genom-Projekt i 2003 indledte en ny æra af en hurtig, billig og præcis genom—analyse, der hedder Next Generation Sequencing (NGS). NGS bygger på” første generation sekventering ” teknologier til at give nøjagtige og omkostningseffektive sekventering resultater.Fred Sanger sekventerede det første hele DNA-genom, virusfagen ?17174, i 1977., Samme år udviklede Sanger den fremtidige rygrad i genom-æraen: DNA-sekventeringsteknologi. Hans teknik brugte kædeafslutningsmetoden. Dette ses nu som den” første generations teknologi ” af genomsekvensering.

da Sanger-sekventering (eller kædetermineringsmetoden) er den første generation af sekventeringsteknologi, er det meget vigtigt at forstå det. Det menneskelige genomprojekt begyndte med Sanger-sekventeringsteknologi.,

Den Sanger Sekventering Metode

Sanger sekventering metoden bygger på dideoxynucleotides (ddNTPs),en type af deoxynucleoside trifosfater (dntp ‘er), der mangler en 3’ – hydroxyl gruppe og har et hydrogen-atom i stedet . Når disse baser binder til den voksende DNA-sekvens, afslutter de replikation, da de ikke kan binde andre baser. For at udføre Sanger-sekventering tilføjer du dine primere til en opløsning, der indeholder den genetiske information, der skal sekventeres, og opdeler derefter opløsningen i fire PCR-reaktioner., Hver reaktion indeholder en med dNTP blanding med en af de fire nukleotider substitueret med en ddNTP (A, T, G og C ddNTP grupper). I slutningen af PCR vil hver af dine fire reaktioner give PCR-produkter i forskellige længder, fordi replikation tilfældigt afsluttes. Ved at køre prøverne på en gel med 4 baner, kan du sammenstykke sekvensen, da hver sekvens er blevet replikeret fra det samme originale materiale. Her er et eksempel, hvor ddNTP ‘erne er med fed skrift, og dNTP’ erne ikke er:

din sekvens er atgctcag.,

Dine fire reaktioner giver dig:
Reaktion med ddATP: EN, ATGCTCA, ATGCTCAG
Reaktion med ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reaktion med ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reaktion med ddTTP: PÅ, ATGCT, ATGCTCAG

Alle de reaktioner en gang køre en gel ville se noget som dette (Billede af Olwen Reina):

Hvert bånd angiver de forskellige længder kode. For eksempel bandet er den rigtige under ” A ” symboliserer sekvensen: “atgctca”

stadig forvirret?

lad os forestille os et festspil. Spillet er et gætteleg., Sådan spilles det:

du tænker på et nummer, og gruppen skal gætte det. Den vanskelige del er, at tallet er 200-cifre i længden. Du læser cifrene i nummeret i dit hoved uden at lave en lyd. Hver gang afbryder en person dig så ofte, og du fortæller dem det enkeltciffer, du bare tænkte, og hvor det er i sekvensen af 200. Hver gang du bliver afbrudt, skal du starte igen. Du forlader efter et par timer, og gruppen skal finde ud af det 200-cifrede nummer., De er nødt til at samle de oplysninger, du gav dem, for eksempel det 25.nummer var 5, Det 40. nummer var 0, og så videre. Ved hjælp af oplysningerne fra deres afbrydelser kan de gentage det nummer, de gav dig.selvom dette lyder som det lameste spil i verden, fungerer det meget godt til sekventering!

Desværre er det langsomt, dyrt og (tidligere) afhængig af radioaktive materialer. Dette pressede forskere til at udvikle nye og bedre former for genomsekvensering.,

næste generations Sekventeringsteknologier

de største fremskridt inden for genomsekvensering har øget hastighed og nøjagtighed, hvilket resulterer i reduktion i arbejdskraft og omkostninger. Hastigheden er takket være parallel analyse og høj gennemløbsteknologi. Det er forskellen mellem at få en 4 årige til at læse Moby Dick og give et afsnit hver til en flok Drama majors og beder dem om at læse på .n gang.

Sekventeringsmaskiner er forbedret vildt, siden Sanger udviklede sin metode., I 1987 blev Applied Biosystems den første til at introducere en automatisk sekventeringsmaskine, kaldet AB370. Maskinen var afhængig af en metode kaldet kapillærelektroforese, der brugte Sanger ‘ s kædeafslutningsmetode uden at have brug for en gel.

fluorescerende mærkede kædeterminerende ddNTP ‘ er sættes til PCR-reaktionsblandingen. Ved Sanger-sekventeringsmetoden oprettes PCR-produkter af forskellige længder og adskilles derefter efter deres størrelse. Størrelsen måles ved PCR-produktets samlede negative ladning. Jo mere negativ ladningen er, desto længere er fragmentet., Tag ovenstående eksempel på ddNTP-inkorporering og forestil dig, at de dristige bogstaver er ddNTPs med en fluorokrom vedhæftet. Som fragmenter, der er trukket mod den positive elektrode af et kapillarrør (se billedet nedenfor), vil de passere en laserstråle, der udløser et lysglimt fra fluorochrom knyttet til ddNTP, der er karakteristisk for den base type (for eksempel, grøn til gul til T, blå for G, rød for C). På denne måde læses genomet omhyggeligt.

den største forskel her var hastighed og omkostninger., AB370 kunne registrere 96 baser på onen gang, 500K baser om dagen, og havde en læse længde på 600 baser ved hjælp af en parallel analyse og høj gennemløb setup. Denne form for sekventering blev hovedværktøjet til færdiggørelsen af det menneskelige genomprojekt.

Hvordan sammenligner NGS med første generations sekventering?

NGS er kendetegnet ved forbedret nøjagtighed og hastighed, men også reduceret arbejdskraft og omkostninger. Der har aldrig været en tid, hvor det har været så billigt, praktisk, eller ligetil at sekvensere et genom., Sandsynligvis har den største forbedring været udviklingen af parallel analyse, hvilket øgede sekventeringshastigheden.

det eneste, der bremser os nu, er fortolkningen af resultater!