læringsmål

  • Genkald dideoxynucleotide sekventering

Sanger-sekventering, også kendt som kæde-opsigelse-sekventering, henviser til en metode til DNA-sekventering, der er udviklet af Frederick Sanger i 1977. Denne metode er baseret på amplifikation af DNA-fragment, der planlægges af DNA-polymerase og inkorporering af modificerede nukleotider – specifikt, dideoxynucleotides (ddNTPs).,

Den klassiske kæde-opsigelse metode, der kræver en enkelt-strenget DNA-skabelon, en primer DNA, DNA-polymerase, normal deoxynucleotidetriphosphates (dntp ‘ er), og modificerede nukleotider (dideoxyNTPs) at opsige DNA strand forlængelse. Disse kædeterminerende nukleotider mangler en 3 ‘ – OH-gruppe, der kræves til dannelse af en phosphodiesterbinding mellem to nukleotider, hvilket får DNA-polymerase til at ophøre med forlængelse af DNA, når en ddNTP er inkorporeret. DdNTP ‘ erne kan være radioaktivt eller fluorescerende mærket til detektion i automatiserede sekventeringsmaskiner.,DNA-prøven er opdelt i fire separate sekventering reaktioner, der indeholder alle fire standard deoxynucleotides (dATP, dGTP, dCTP og dTTP), og DNA-polymerase. Til hver reaktion tilsættes kun en af de fire dideo .ynukleotider (ddATP, ddGTP, ddCTP eller ddTTP). Efter runder med template-DNA-forlængelse fra den bundne primer opvarmes de resulterende DNA-fragmenter og adskilles efter størrelse ved hjælp af gelelektroforese. Dette udføres ofte under anvendelse af en denaturerende polyacrylamid-urinstofgel, hvor hver af de fire reaktioner løber i en af fire individuelle baner (baner A, T, G, C)., DNA-båndene kan derefter visualiseres ved autoradiografi eller UV-lys, og DNA-sekvensen kan aflæses direkte af røntgenfilmen eller gelbilledet.

Figur: Sanger-sekventering: Forskellige typer af Sanger-sekventering, som alle afhænger af den sekvens, der bliver stoppet af en afslutning dideoxynucleotide (sorte søjler).,

Tekniske variationer af kæde-opsigelse sekventering omfatter tagging med nukleotider, der indeholder radioaktivt fosfor til radioaktiv mærkning, eller brug en primer mærket på 5′ ende med et fluorescerende farvestof. Dye-primer sekventering letter læsning i et optisk system, for hurtigere og mere økonomisk analyse og automatisering. Den senere udvikling af Leroy Hood og kolleger af fluorescerende mærkede ddNTPs og primere satte scenen for automatiseret, DNA-sekventering med høj gennemstrømning. Kæde-termineringsmetoder har i høj grad forenklet DNA-sekventering., For nylig er farvestof-terminator sekventering blevet udviklet. Farvestof-terminator sekventering anvender mærkning af kæden terminator ddNTPs, som tillader sekventering i en enkelt reaktion, snarere end fire reaktioner som i mærket-primer metode. I farvestofterminatorsekventering er hver af de fire dideo .ynukleotidkædeterminatorer mærket med fluorescerende farvestoffer, der hver udsender lys ved forskellige bølgelængder.,

Figur: Kromatografen: Dette er et eksempel på resultatet af en Sanger sekventering læse ved hjælp af fluorescently mærket dye-terminators. De fire DNA-baser er repræsenteret af forskellige farver, som fortolkes af Soft .aren for at give DNA-sekvensen ovenfor.

automatiserede DNA-sekventeringsinstrumenter (DNA-sekvensere) kan sekvensere op til 384 DNA-prøver i en enkelt batch (Kør) i op til 24 kørsler om dagen., DNA-se .uencere udfører kapillærelektroforese til størrelsesseparation, detektion og registrering af farvestoffluorescens og dataudgang som fluorescerende peak trace kromatogrammer. Automatisering har ført til sekventering af hele genomer.

hovedpunkter

  • manglen på Den anden deoxy-gruppen om en dNTP gør det ddNTP, stopper indarbejdelse af yderligere nukleotider, denne opsigelse skaber DNA længder stoppede ved hver nukleotid, er central for yderligere at identificere hver nukleotid.,
  • forskellige etiketter kan bruges, ddNTPS, dntps og primere kan alle mærkes med radioaktivitet og fluorescerende.
  • ved hjælp af fluorescerende etiketter kan dideo .y-sekventering automatiseres, hvilket tillader high-throughput-metoder, der er blevet brugt til at sekvensere hele genomer.

nøgleord

  • kromatogram: det visuelle output fra en kromatograf. Normalt et grafisk display eller histogram.
  • dideoxynucleotide: Enhver nukleotid dannet fra en deoxynucleotide ved tab af en anden hydroxy-gruppen fra deoxyribose-gruppen