finalizarea Proiectului Genomului Uman, în 2003, a inaugurat o nouă eră de rapide, accesibile și corecte analiza genomului—numita Next Generation Sequencing (NGS). NGS se bazează pe tehnologii de „secvențiere de primă generație” pentru a obține rezultate de secvențiere precise și rentabile.Fred Sanger a secvențiat primul genom ADN întreg, virusul fag ?X174, în 1977., În același an, Sanger a dezvoltat viitoarea coloană vertebrală a erei genomului: tehnologia de secvențiere a ADN-ului. Tehnica sa a folosit metoda de terminare a lanțului. Aceasta este văzută acum ca „tehnologia de primă generație” a secvențierii genomului.deoarece secvențierea Sanger (sau metoda de terminare a lanțului) este prima generație de tehnologie de secvențiere, înțelegerea acesteia este foarte importantă. Proiectul genomului uman a început cu tehnologia de secvențiere Sanger.,
Metoda de Secvențiere Sanger
metoda de secvențiere Sanger se bazează pe dideoxynucleotides (ddNTPs),un tip de dezoxinucleozid trifosfați (dNTPs), care nu dispun de un 3′ grupare hidroxil și un atom de hidrogen în loc . Când aceste baze se leagă de secvența ADN în creștere, ele termină replicarea, deoarece nu pot lega alte baze. Pentru a efectua secvențierea Sanger, adăugați primerii la o soluție care conține informațiile genetice care trebuie secvențiate, apoi împărțiți soluția în patru reacții PCR., Fiecare reacție conține un amestec dNTP cu unul dintre cele patru nucleotide substituite cu un ddNTP (grupuri A, T, G și C ddNTP). La sfârșitul PCR, fiecare dintre cele patru reacții va produce produse PCR de diferite lungimi, deoarece replicarea este terminată aleatoriu. Prin rularea probelor pe un gel cu 4 benzi, puteți pune împreună secvența, deoarece fiecare secvență a fost reprodusă din același material original. Aici este un exemplu unde ddNTPs sunt în bold și dNTPs nu sunt:
secvența este ATGCTCAG.,
cele patru reacții da:
Reacție cu ddATP: O, ATGCTCA, ATGCTCAG
Reacție cu ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reacție cu ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reacție cu ddTTP: LA, ATGCT, ATGCTCAG
Toate reacțiile după ce rulați un gel ar arata ceva de genul asta (Imaginea de Olwen Reina):
Fiecare bandă denotă diferite lungimi de cod. De exemplu, banda este dreptul de sub” A „simbolizează secvența: „ATGCTCA”
încă confuz?să ne imaginăm un joc de petrecere. Jocul este un joc ghicitul., Iată cum se joacă:
vă gândiți la un număr și grupul trebuie să-l ghicească. Partea dificilă este că numărul are o lungime de 200 de cifre. Citiți cifrele numărului din cap fără a face un sunet. De fiecare dată când o persoană te întrerupe, și le spui singura cifră la care te gândeai și unde se află în secvența de 200. De fiecare dată când sunt întrerupte, trebuie să înceapă din nou. Pleci după câteva ore și grupul trebuie să-și dea seama de numărul de 200 de cifre., Trebuie să pună cap la cap informațiile pe care le-ați dat, de exemplu numărul 25 a fost 5, numărul 40 a fost 0 și așa mai departe. Folosind informațiile din întreruperile lor, ei pot repeta numărul pe care ți l-au dat.în timp ce acest lucru sună ca cel mai lamest joc din lume, funcționează foarte bine pentru secvențiere!din păcate ,este lent, scump și (anterior) se bazează pe materiale radioactive. Acest lucru a împins oamenii de știință să dezvolte forme noi și mai bune de secvențiere a genomului.,cele mai mari progrese în secvențierea genomului au fost creșterea vitezei și a preciziei, ceea ce a dus la reducerea forței de muncă și a costurilor. Viteza este datorită analizei paralele și tehnologiei cu randament ridicat. E diferenta intre a obtine un copil de 4 ani sa citeasca Moby Dick si a da cate un paragraf fiecaruia la o gramada de drame majore si a le cere sa citeasca imediat.mașinile de secvențiere s-au îmbunătățit sălbatic de când Sanger și-a dezvoltat metoda., În 1987, Applied Biosystems a devenit primul care a introdus o mașină automată de secvențiere, numită AB370. Mașina s-a bazat pe o metodă numită electroforeză capilară care a folosit metoda de terminare a lanțului Sanger fără a avea nevoie de gel.
ddNTPs cu capăt de lanț marcat fluorescent se adaugă la amestecul de reacție PCR. Prin metoda secvențierii Sanger, se creează produse PCR de diferite lungimi și apoi se separă în funcție de mărimea lor. Dimensiunea este măsurată prin încărcarea negativă totală a produsului PCR. Cu cât încărcarea este mai negativă, cu atât fragmentul este mai lung., Luați exemplul de mai sus de încorporare ddNTP și imaginați-vă că literele aldine sunt ddNTPs cu un fluorochrom atașat. Ca fragmentele sunt trase spre electrodul pozitiv de un capilar (vezi imaginea de mai jos), se trece un fascicul laser, care declanseaza un flash de lumină de la fluorocromului atașat la ddNTP, care este caracteristică de bază tip (de exemplu, verde pentru Un galben, pentru T, albastru pentru G, de culoare roșie pentru C). În acest fel, genomul este citit cu atenție.
Cea mai mare diferență a fost de viteză și cost., AB370 ar putea detecta bazele 96 la un moment dat, bazele 500k pe zi și a avut o lungime de citire a bazelor 600 utilizând o analiză paralelă și o configurare de mare viteză. Această formă de secvențiere a devenit principalul instrument pentru finalizarea proiectului genomului uman.
cum se compară NGS cu secvențierea din prima generație?NGS se caracterizează printr-o precizie și viteză îmbunătățite, dar și prin reducerea forței de muncă și a costurilor. Nu a existat niciodată un moment în care a fost la fel de ieftin, convenabil sau simplu să se secvențieze un genom., Fără îndoială, cea mai mare îmbunătățire a fost dezvoltarea analizei paralele, care a crescut viteza de secvențiere.singurul lucru care ne încetinește acum este interpretarea rezultatelor!
v-a ajutat acest lucru? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.
Lasă un răspuns