Remarcabil Anti-Trichomonas vaginalis Activitatea de Plante Utilizate în mod Tradițional de către Mbyá-Guarani Grup de Indigeni din Brazilia

Abstract

Trichomonas vaginalis, un protozoare flagelate, este agentul cauzator de trichomonoza, cele mai frecvente nonviral boală cu transmitere sexuală la nivel mondial. Având în vedere prevalența crescută a izolatelor rezistente la metronidazol, medicamentele alternative sunt esențiale pentru tratamentul cu succes. Produsele naturale sunt sursa celor mai noi medicamente, iar înțelepciunea populară despre utilizarea plantelor medicinale este un instrument puternic în această căutare., În acest studiu, activitatea a 10 plante medicinale utilizate pe scară largă în viața de zi cu zi de Grupul indigen Mbyá-Guarani a fost evaluată împotriva a șapte izolate diferite de T. vaginalis. Printre extractele apoase testate, Verbena sp. (Guachu ka ‘ a în Mbyá-limba Guarani) și Campomanesia xanthocarpa (Guavira în Mbyá-limba Guarani) a arătat cea mai mare activitate împotriva T. vaginalis cu MICROFON valoare de 4,0 mg/mL ajunge la 100% din eficacitatea împotriva parazitului. Testele de creștere cinetică au arătat că extractele au promovat eliminarea completă a creșterii după 4 ore de incubare., În plus, extractele testate nu au promovat o activitate hemolitică semnificativă împotriva eritrocitelor umane. Rezultatele noastre arată pentru prima dată activitatea potențială a Verbena sp. și C. xanthocarpa împotriva lui T. vaginalis. În plus, acest studiu demonstrează că cunoștințele indigene reprezintă o sursă importantă de noi agenți antiprotozoale prototip.

1. Introducere

Trichomonas vaginalis parazitează tractul uman urogenital provocând trichomonoză, cea mai răspândită boală cu transmitere sexuală non-virală la nivel mondial, fiind responsabilă pentru 248 de milioane de cazuri noi anual ., După colonizare, parazitul provoacă vaginită, uretrită și prostatită . Mai mult , agentul patogen a fost asociat cu consecințe grave , cum ar fi rezultatele negative ale sarcinii și nașterea prematură , infertilitatea, predispoziția la cancerul de col uterin și boala inflamatorie pelvină . Foarte important, trichomonoza acționează ca un cofactor în transmiterea și achiziția virusului imunodeficienței umane (HIV). În ciuda impactului acestei infecții, arsenalul terapeutic este restricționat și numai metronidazolul și tinidazolul, ambele medicamente 5-nitroimidazol, sunt aprobate de FDA pentru tratamentul trichomonozei ., Deși rata de vindecare este ridicată, eșecul tratamentului poate fi observat, iar rezistența izolatelor T. vaginalis este principalul motiv al eșecului tratamentului . În acest sens, fără îndoială, este necesar ca ancheta pentru noi alternative pentru tratamentul de trichomonoza și două strategii pot fi urmate: (i) căutarea de noi ținte terapeutice, care este esențială pentru o dezvoltare rațională a noilor agenți antiparazitari și (ii) investigarea de noi anti-T., vaginalis compuși structurali distincți de 5-nitroimidazoli și, în consecință, acționând prin mecanism diferit, așa cum a demonstrat grupul nostru .în acest context, produsele naturale, în special plantele medicinale, sunt incomensurabile ca o sursă puternică de molecule bioactive. Din cele mai vechi timpuri, oamenii folosesc plante pentru a trata bolile infecțioase comune, iar unele dintre aceste medicamente tradiționale sunt încă integrate ca parte a vindecării diferitelor patologii . În plus, căutarea bazată pe informații etnofarmacologice salvează imensa cunoaștere empirică a utilizării plantelor ., În acest context, în ceea ce privește mediul natural și bogăția vastă a resurselor genetice, Brazilia este o țară de mare interes pentru Etnofarmacologie .oamenii indigeni au o multitudine de informații despre biodiversitate și știu cum să capteze și să utilizeze resursele naturale . În ciuda faptului că mai multe medicamente au fost descoperite prin cure tradiționale și cunoștințe populare, în Brazilia există 122 de grupuri etnice indigene, dar doar 30% dintre ele au fost investigate în ceea ce privește aspectele etnobotanice ., Prin urmare, studiul plantelor utilizate de medicina indigenă este important pentru a interconecta medicina tradițională și mediul biotic, păstrând cunoștințele antice indigene.protozoarele parazitare rămân o amenințare majoră pentru sănătatea umană și animală și există puține medicamente eficiente pentru tratamentul multor boli protozoare. Luând în considerare etnofarmacologia indigenă ca factor care contribuie la screeningul sistematic al plantelor cu activitate antiprotozoală, acest studiu a evaluat anti-T., activitatea vaginalis a celor mai importante plante medicinale utilizate în medicina indigenă Mbyá-Guarani situată în sudul Braziliei.

2. Materiale și metode

2.1. Condiții de cultură a paraziților

în acest studiu, șapte izolate de T., vaginalis-au folosit: 30236 și 30238 de la American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2, și TV-LACM3 (proaspete clinice izolate de la pacienții de sex feminin); TV-LACH1 și TV-LACH2 (proaspete clinice izolate de la pacienții de sex masculin) toate de Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brazilia (proiect cu etice aprobarea de către UFRGS Etică, Comitetul de Cercetare, numărul 18923). Trichomonadele au fost cultivate axenic în mediu tripticază-extract de drojdie-maltoză (TYM) (pH 6,0), suplimentat cu ser bovin inactivat termic 10% și incubat la 37°C.

2. 2., Materialul vegetal

materialul vegetal a fost colectat din tribul indigen Mbyá-Guarani situat la Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brazilia (30°06’47.62″ s și 51°07’37.85″ W), în martie 2011. Acest sat este denominat Tekoá Anhetenguá (în Engleză, adevărat sat), iar 200 de oameni trăiesc în zonă adunați la 40 de familii. Femeile din sat au cunoștințe despre plantele medicinale folosite de întreaga populație și au efectuat colectarea specimenelor. Au fost colectate zece plante utilizate în mod obișnuit în medicina indigenă pentru bolile infecțioase: frunze de aloe arborescens Mill., (ICN 173371), părți aeriene din Bidens pilosa L. (ICN 167397), părți aeriene de Rhipsalis baccifera (ICN 167402), latra de Luehea divaricata (ICN 167403), rădăcini de Trichilia sp. (ICN 173126), frunze de Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), frunze de Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), frunze de Citrus limonium (ICN 167399), frunze de Citrus reticulata (ICN 173127), și frunze de Verbena sp. (ICN 167394). Exemplarele voucherului au fost depuse la herbarul Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN).

2. 3., Prepararea extractelor de plante

extractele de plante proaspete au fost preparate conform utilizării tradiționale de către indigeni prin decoct la 60°C timp de 60 min . Extractele apoase au fost liofilizate, iar soluția de lucru a fost preparată la 8,0 mg / mL în apă ultrapură, sterilizată prin filtrare (0,22 µm) și depozitată la -20°C.

2,4. Testul anti-Trichomonas vaginalis

zece extracte apoase au fost testate in vitro pentru activitatea împotriva T. vaginalis. Testul a fost efectuat în 96 de plăci de microtitrare la concentrația finală de 4,0 mg/mL în godeuri., Concentrația minimă inhibitorie (CMI) a fost determinată utilizând o diluție de opt ori (4,0–0,031 mg/mL), iar viabilitatea trofozoitelor a fost determinată conform unei metode fluorimetrice . Au fost efectuate două controale: control negativ numai cu trofozoiți și control pozitiv cu metronidazol de 8,0 µM (Sigma Chemical Co. Louis, MO, SUA). Experimentele au fost efectuate cel puțin în trei experimente independente, în trei exemplare. Rezultatele au fost exprimate ca procent de trofozoiți viabili comparativ cu paraziți netratați.

2, 5., Efectul de creștere al extractelor apoase

pentru a investiga efectul extractelor apoase active asupra creșterii T. vaginalis, a fost efectuată o curbă de creștere cinetică utilizând izolatul ATCC 30236. Densitatea inițială a paraziților de 2,0 × 105 trofozoiți / mL a fost incubată cu extractele la valoarea CMI în mediu TYM. Trofozoiții au fost numărați folosind un hemocitometru în timpul 72 h. rezultatele au fost exprimate ca număr de trofozoiți (105/mL)., Pentru analiza microscopică, controalele și tratate paraziți au fost centrifugate timp de 10 min la 2.000 rpm pentru a se concentra la organisme după 4 ore de incubare, și pregătirea a fost observată la microscop optic (amplificat ×1,000) de trypan blue vopsea de excludere.

2, 6. Testul hemolitic

Acest test a fost efectuat conform metodei utilizate de Rocha et al. . Tipul de sânge O pozitiv de la voluntarii umani sănătoși a fost colectat cu soluția Alsever (1: 1) și centrifugat la 2,000 rpm timp de 5 min. Fracția de eritrocite a fost spălată de trei ori cu PBS 1x (pH 7.,0) și omogenizați pentru a obține 1% suspensie eritrocitară (v/v). Concentrațiile extractelor apoase au fost alese în funcție de concentrația minimă inhibitorie (CMI) determinată în testul de sensibilitate. Eritrocitele au fost incubate cu extractele la 37°C sub agitare timp de 1 h și apoi au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 5 min. Absorbția supernatantului a fost măsurată la 540 nm. Experimentul a fost efectuat în trei exemplare, iar procentul de hemoliză cauzat de fiecare probă testată a fost calculat în comparație cu activitatea hemolitică 100% a saponinei din Quillaja saponaria .

3., Rezultate și discuții

Acest studiu a evaluat activitatea anti-T. vaginalis a extractelor apoase din 10 plante medicinale utilizate în sistemul de medicină Mbyá-Guarani. Foarte important, printre plantele testate, am găsit două extracte apoase cu o puternică activitate anti-T. vaginalis in vitro. Extractele promițătoare sunt de Verbena sp. și Campomanesia xanthocarpa. Extractul din Verbena sp. la 4.0 mg/mL, a demonstrat optimă anti-T. vaginalis activitate de inducere complet citotoxicitate (100% din parazitii moartea) la toate distincte trichomonads izolate (Figura 1(a))., Frunze extract de Campomanesia xanthocarpa la aceeași concentrație, de asemenea, a arătat o foarte mare anti-T. vaginalis activitate, reducerea parazit viabilitatea până la 96% (Figura 1(b)). alte extracte apoase au prezentat o varietate de rezultate. Extractul apos obținut din Bidens pilosa a eliminat în totalitate viabilitatea trofozoiților numai pentru izolatul 30236 [Figura 1 litera(c)]. Extractul de scoarță de luehea divaricata a indus o reducere a viabilității T. vaginalis în mod diferit în fiecare izolat de trichomonade testat (Figura 1(d))., Frunzele de Coix lacryma-jobi induse, în medie, 75% din reducerea viabilității pe T. vaginalis izolate; cu toate acestea, pentru TV-LACH2 izola, reducerea a fost de doar 40% (Figura 1(e)). Proaspăt izolate clinice la pacienții de sex masculin (TV-LACH1 și TV-LACH2) a prezentat sensibilitate mai mare decât tulpinile izolate de la pacienții de sex feminin (ATCC și proaspăt clinice) atunci când extract de rădăcină de Trichilia sp. a fost testat [Figura 1(f)]. Extractele de frunze Din Citrus limonium au redus cu aproximativ 40% viabilitatea izolatelor [Figura 1 (g)]., Extractele de Aloe arborescens și Citrus reticulata a scăzut viabilitatea de 50% de cel puțin un izolat (Figurile 1(h) și 1(i)), în timp ce Rhipsalis baccifera redus doar 30% viabilitatea 30236 și TV-LACM2 izolate (Figura 1(j)).în comparație cu celelalte extracte, extractele din Verbena sp. și C. xanthocarpa a demonstrat cea mai promițătoare activitate împotriva T. vaginalis, iar concentrația minimă inhibitorie a fost determinată pentru izolatul 30236 (Tabelul 1).,

pentru a investiga efectul extractului cel mai activ asupra creșterii și viabilității paraziților, a fost efectuată o curbă cinetică de creștere. Controlul a prezentat vârful de creștere clasic după 24 de ore de incubare; cu toate acestea, organismele tratate cu extracte de Verbena sp. și C., xanthocarpa, după 4 ore de incubare, evocat o creștere completă desființarea (Figura 2) și a arătat o caracteristică de culoare albastru de trypan blue vopsea de excludere indicând moartea celulelor (Figura 3).

Figura 2

Cinetică curba de creștere de Trichomonas vaginalis 30236 izola după tratamentul cu extracte apoase de Verbena sp. și Campomanesia xanthocarpa la 4,0 mg / mL. Creșterea trofozoitelor a fost complet inhibată de extracte în 4 ore de incubație., Data represent means ± standard deviation of at least three experiments, all in triplicate.

(a) Control

(b) Verbena sp.

(c) Campomanesia xanthocarpa

(a) Control
(b) Verbena sp.,
(c) Campomanesia xanthocarpa

Figura 3

analiza Microscopică a paraziților morfologie în lumina microscopului (amplificat ×1,000) de trypan blue vopsea de excludere. (a) Control; (b) după 4 ore de tratament cu extract apos de Verbena sp.; (c) după 4 ore de tratament cu extract apos de Campomanesia xanthocarpa.

pentru a investiga un posibil efect al C. Xanthocarpa și Verbena sp., pe membrana paraziților și, de asemenea, pentru a avea date preliminare privind citotoxicitatea împotriva celulelor de mamifere, a fost efectuată activitatea hemolitică a acestor extracte. Verbena sp. și extractele de C. xantocarpa au fost testate la valorile CMI și au demonstrat Liza eritrocitelor 6,5 și respectiv 7,6% (Tabelul 1). Aceste rezultate au demonstrat că ambele extracte, la valorile CMI, nu au promovat o activitate hemolitică semnificativă, indicând faptul că mecanismul de acțiune responsabil pentru reducerea viabilității parazitului probabil nu implică perturbarea membranei parazitare., Mai mult și mai important, aceste constatări sugerează că ambele extracte nu sunt toxice pentru celulele mamiferelor, deoarece nu au lizat eritrocitele umane.acest studiu contribuie la salvarea cunoștințelor indigene despre plantele medicinale. Indigenii Mbyá-Guarani folosesc Verbena sp. (Guachu ka ‘ A în limba Mbyá-Guarani), ca ceai, pentru ameliorarea simptomelor bolilor infecțioase, cum ar fi febra. Acest lucru este în acord cu literatura de specialitate care se referă Verbena sp. infuzie ca sedativ, analgezic la tulburări inflamatorii, arsuri ale pielii, amenoree, depresie și boli gastrice ., Mai mult decât atât, această specie are o varietate de constituenți chimici, ca de flavonoide, iridoid glicozide, phenylpropanoid glicozide, steroli, triterpene, și glycoconjugate, și activitatea biologică poate fi parțial atribuită ei . În plus, acest trib utilizeaza frunzele de C. xanthocarpa (Guavira în Mbyá-limba Guarani) pentru tratamentul de diaree, dureri de stomac, și viermi., Această plantă este utilizată în mod tradițional în partea de sud a Braziliei ca depurative, antidiarrhoeic, demachiant, și antireumatice, și pentru a reduce colesterolul din sânge , și aceste proprietăți pot fi atribuite taninuri, saponine și flavonoide (quercetină, myricetin, quercitrina, și rutin), compuși prezenți în frunzele de C. xanthocarpa .etnofarmacologia de salvare a utilizărilor istorice ale plantelor este recunoscută ca fiind valoroasă pentru bioprospecție, deoarece acestea oferă rațiunea pentru selecția și cercetarea plantelor medicinale ., Acest studiu descrie primul raport privind activitatea antiprotozoală a verbenei sp. și C. xantocarpa. În plus, alte specii din familiile Verbenaceae și Myrtaceae au fost testate împotriva T. vaginalis, cu toate acestea, fără succes . Mai multe biodiversități și cunoștințe tradiționale ale diferitelor populații au ghidat studii pentru a căuta noi prototipuri anti-T. vaginalis. Recent, a fost raportat potențialul plantelor utilizate în mod tradițional de la Caatinga împotriva T. vaginalis . Calzada și colab., a demonstrat că plantele utilizate pentru tulburări ale tractului urogenital în medicina tradițională mexicană au arătat efect împotriva acestui protozoar. Speciile Amaryllidaceae utilizate împotriva bolilor venerice din Africa de Sud au arătat, de asemenea, o activitate promițătoare împotriva T. vaginalis . având în vedere impactul trichomonozei în sănătatea publică și numărul emergent de izolate rezistente la T. vaginalis, sunt necesare alternative pentru tratamentul acestei infecții. Produsele naturale sunt o sursă promițătoare de molecule active, iar abordarea etnofarmacologică salvează cunoașterea populației de plante medicinale., Această înțelepciune combinată cu studii chimice și farmacologice prezintă o valoare prețioasă în bioprospecția medicamentelor inovatoare, sigure și accesibile. Acest studiu pionier a demonstrat rezultate relevante despre activitatea anti-T. vaginalis a verbenei sp. și C. xanthocarpa, plante utilizate în mod tradițional de populația indigenă Mbyá-Guarani pentru boli infecțioase. În ciuda faptului că a arătat o activitate puternică anti-T. vaginalis, acest raport a salvat cunoștințele oamenilor indigeni, evitând avortul acestei înțelepciuni.,contribuția autorilor Clara Lia Costa Brandelli și Patrícia de Brum Vieira au contribuit în egală măsură la această lucrare. această lucrare a fost susținută de programul NANOBIOTEC-Brazilia de la CAPES și FAPERGS. Autorii mulțumesc Căpetenie José Cirilo Pires Morinico (trib Mbyá-Guarani), pentru a face posibilă realizarea acestui studiu și pentru informații valoroase. Alexandre José Macedo și Tiana Tasca mulțumesc CNPq pentru bursele de cercetare.