TEXT

Natalizumab, un anticorp utilizate pentru a trata recurent scleroza multiplă (MS), previne traficul de limfocite activate, inclusiv limfocite autoreactive, prin bariera hemato-encefalică (BHE). Principalul efect advers al natalizumab este leucoencefalopatia multifocală progresivă( LMP), o boală demielinizantă devastatoare cauzată de replicarea poliomavirusului JC uman (JCV) în oligodendrocite și astrocite (1, 2)., Inhibarea de către Natalizumab a traficului efector de celule T din sânge către sistemul nervos central (SNC) ar putea favoriza replicarea locală a JCV (3-7).aici, am examinat prezența celulelor T de memorie efectoare specifice JCV (TEM) în sângele pacienților cu SM După activarea antigenului peste noapte ex vivo. In vivo, numerele TEM specifice scad odată ce antigenul înrudit este eliminat (8-10), iar prezența lor poate indica astfel replicarea JCV în curs de desfășurare. TEM eliberează rapid citokine, cum ar fi interferonul gamma (IFN-γ) atunci când sunt reexpuse la antigen., Un test anterior al locului imunosorbant legat de enzime (elispot) a examinat expresia IFN-γ în celulele T După activarea pe termen lung cu peptide JCV timp de până la 14 zile (11). Cu toate acestea, activarea prelungită permite reactivarea și extinderea memoriei celulelor T în repaus pe termen lung, ceea ce înseamnă că un răspuns pozitiv nu înseamnă neapărat un răspuns imun continuu. Aici, am examinat mai întâi prezența TEM specifică JCV la doi pacienți cu SM care au dezvoltat LMP. Primul pacient a fost diagnosticat cu LMP după 39 de luni pe natalizumab (39 perfuzii) (Departamentul de Neurologie, Spitalul Pitié-Salpétrière)., Ea avea 39 de ani și avea o istorie de 10 ani de SM recurent-remisivă.înainte de natalizumab, ea a primit ciclofosfamidă și mitoxantronă. LMP a fost confirmată prin RMN și PCR JCV pe lichidul cefalorahidian (LCR). Când a fost testată pentru TEM specifică JCV, la 8 săptămâni de la debutul simptomelor LMP, ea a avut 1,040 copii ale genomului JCV per ml de CSF (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Ei celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost activate in vitro în SCOPUL-V și Albumax mediu (Invitrogen), timp de 16 h, cu purificată JCV (tulpina MAD-4; LGC Promochem; 104.5 de tesut de 50% doză infectantă pe culturi /0,2 ml)., Nu s-a adăugat interleukină 2 recombinantă (IL-2). O cantitate de virus corespunzătoare 5,534 PFU a fost adăugată la fiecare godeu. Aceasta a corespuns unei multiplicități de infecție (MOI) de 0, 02. Celulele au fost apoi testate pentru IFN-γ intracelular prin citometrie în flux. Mortalitatea celulară după activarea peste noapte a fost mai mică de 5%. Așa cum se arată în Fig. 1A și andB,B, răspunzând celulele au fost detectate în ambele CD4 și CD8 T-celule mici, și cele mai multe dintre ele au avut CCR7− CD45RA− fenotip caracteristic de memorie efectori (12)., Anti-JCV TEM au fost, de asemenea, detectate de IFN-γ ELISPOT (de captare și de detectare a anticorpilor, clone 1-D1 si K7-B6-1, respectiv; Mabtech) următoarele 16 h de activare cu purificată JCV sau VP-1 peptide (un mix de 14 bazine de suprapunere 15-amino-acid peptide care acoperă întreaga JCV VP-1 de proteine ) (Fig. 1C). Cel de-al doilea pacient avea 46 de ani și avea un istoric de 11 ani de SM recurent-remisivă.înainte de natalizumab, ea a primit interferon beta, acetat de glatiramer, azatioprină și mitoxantronă. Ea a fost trimisă la Spitalul Tenon MS center pentru reevaluare după 24 de perfuzii cu natalizumab., Un RMN cerebral efectuat în Mai 2012 a detectat o leziune suspectă T2-hiperintensă mică, liniară, în regiunea frontală dreaptă juxtacorticală. Primul eșantion de CSF a fost negativ pentru JCV. Repetarea RMN după retragerea natalizumab a evidențiat o creștere a dimensiunii leziunii, ceea ce a dus la alte două examinări ale LCR, ambele negative pentru JCV. PCR JCV pe plasmă a fost efectuat la 2 și 4 luni de la debutul LMP. Ambele probe de plasmă au fost negative. Biopsia creierului efectuată în septembrie 2012 a confirmat în cele din urmă diagnosticul de LMP.,

detectarea celulelor T cu memorie efectoare specifice JCV (TEM) în sângele a doi pacienți cu LMP tratați cu natalizumab. În panourile A și B, PBMC de la un pacient care a dezvoltat LMP după tratamentul cu natalizumab (39 perfuzii) au fost activate cu virusul JC purificat peste noapte și apoi testate pentru IFN-γ intracelular prin citometrie în flux în subseturile de celule T CD4 și CD8 (A, respectiv B). Expresia CCR7 și CD45RA pe celulele IFN-γ-pozitive și negative este, de asemenea, prezentată pentru celulele T CD4 (a) și celulele T CD8 (B)., În panelul C, PBMC de la 2 pacienți care au dezvoltat LMP pe natalizumab (pacientul 1 și pacientul 2 au primit 39, respectiv 24 de perfuzii) au fost activate peste noapte cu virusul JC purificat și/sau cu un grup de peptide VP1 înainte de IFN-γ ELISPOT. Numărul de puncte IFN-γ per 0,25 × 106 PBMC După activarea peste noapte cu bazine peptidice JCV și JCV purificate a fost de 54 și, respectiv, 21 (bine netratate, 0 pete) la pacientul 1. La pacientul 2, JCV purificat a produs 15 pete (bine netratate, 0 pete).,analiza ELISPOT a răspunsului IFN-γ la JCV, efectuată la 2 zile după ultima perfuzie cu natalizumab, a arătat prezența TEM specifică JCV în sânge (Fig. 1C). Interesant este că numerele TEM specifice JCV circulante au fost mai mici decât la primul pacient cu LMP, care ar fi putut avea un nivel mai ridicat de replicare a JCV în creier, deoarece JCV PCR pe CSF a fost pozitiv la primul pacient și negativ în al doilea.,

de asemenea, Am examinat prezența JCV specifice TEM de ELISPOT într-o serie de 62 MS pacienții cu scleroză multiplă recurent-remisivă tratați cu natalizumab potrivit Europene în termeni de marketing, precum și în 35 de pacienți cu SM care nu primeau nici o boala-tratament de modificare, și un grup de 40 de donatori sănătoși potrivite pentru vârsta și sex cu pacienții cu SM. Caracteristicile pacienților cu SM sunt prezentate în tabelul 1. Pacienții și donatorii sănătoși și-au dat acordul scris pentru a participa la studiu, care a fost aprobat de Comitetul de etică al Spitalului Pitié-Salpêtrière din Paris., Un răspuns ELISPOT a fost considerat pozitiv dacă numărul corectat de puncte (Numărul de puncte în puțurile activate minus numărul de puncte în puțurile netratate) a fost de cel puțin 10, cu mai puțin de 10 puncte în puțurile netratate.proporția probelor pozitive a fost de 2, 5% la donatorii sănătoși (Fig. 2a). În grupul SM, procentul pacienților pozitivi a crescut cu timpul pe natalizumab (Fig. 2b și andC), C), de la 8,8% la pacienții cu SM netratați la 15,9% la pacienții tratați cu natalizumab mai puțin de 24 luni și 27% la pacienții tratați mai mult de 24 luni (Fig., 2C) (semnificativ pentru pacienții tratați mai mult de 24 de luni față de SM netratată și față de subiecții de control ). Această creștere a frecvenței de detectare a răspunsurilor JCV TEM a sugerat că tratamentul prelungit cu natalizumab a favorizat reactivarea JCV.

detectarea crescută a TEM specifică JCV la pacienții tratați cu natalizumab. Panourile A și B reprezintă numărul de pete IFN-γ per 0,25 × 106 PBMC După activarea peste noapte cu virusul JC purificat la 40 de donatori sănătoși (A) și la 99 de pacienți cu SM în funcție de timpul de administrare a natalizumab (B)., În panoul B, cei 2 pacienți cu LMP sunt indicați printr-un triunghi închis și un pătrat închis. Linia punctată reprezintă cutoff pozitivitate (a se vedea textul). Panoul de C reprezintă procentul de JCV-ELISPOT-probe pozitive la donatori sănătoși (HD), pacienții din grupul de control (Netratate MS), și la pacienții tratați cu natalizumab pentru până la 2 ani (0-24 luni) sau mai multe (24-48 luni). Unii pacienți tratați cu natalizumab au fost testați la 2 sau 3 puncte de timp. Numărul de probe de sânge analizate este indicat mai jos. Analiza statistică a folosit testul lui Fisher., Panoul D prezintă rezultatele JCV ELISPOT pentru pacienții care au fost testați la 2 sau 3 momente de timp. Panoul E prezintă rezultatele testelor urinare JCV PCR și JCV ELISPOT la 50 de pacienți MS tratați cu natalizumab și la 14 donatori sănătoși testați cu ambele teste. Panoul F prezintă rezultatele serologiei JCV și ale JCV ELISPOT la 56 de pacienți cu SM tratați cu natalizumab testat cu ambele teste.un subgrup de pacienți tratați cu natalizumab a fost prelevat de cel puțin două ori (vezi Tabelul 1). Așa cum se arată în Fig. 2D, majoritatea acestor pacienți au devenit sau au rămas pozitivi în timpul perioadei de eșantionare.,rinichiul este un rezervor major pentru JCV. Un procent semnificativ din populația generală excretă virusul în urină, dar nu are dovezi de JCV în sânge (13-15). În plus, prezența ADN-ului JCV în creier pare să fie independentă de prezența sa în rinichi (16). Așa cum se arată în Fig. 2E, 60% dintre pacienții cu SM cu JCV TEM detectabil în sânge nu au avut JCV detectabil în urină, iar 69% dintre pacienții cu PCR JCV pozitiv în urină nu au avut JCV TEM detectabil. De asemenea, la donatorii sănătoși s-a observat excreție urinară de JCV fără JCV TEM detectabil (Fig. 2e)., Acest lucru sugerează că prezența replicării JCV în rinichi nu duce neapărat la detectarea JCV TEM în sânge. În schimb, acest lucru ridică posibilitatea ca detectarea JCV TEM în sânge să reflecte replicarea extrarenală continuă a JCV.

Într-un studiu folosind un roman JCV enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metoda (17 ani), estimat seroprevalența JCV, la pacienții cu SM tratați cu natalizumab a fost 53.6% (17). Seropozitivitatea nu se corelează neapărat cu prezența răspunsurilor TEM, care este legată de reactivarea virusului., De lungă durată celule plasmatice poate persista în măduva osoasă pentru perioade lungi de timp, poate de zeci de ani, menținerea susținută ser titruri de anticorpi fără active patogen replicare (18, 19). Am folosit aceeași metodă ELISA pentru a testa 56 dintre pacienții cu SM tratați cu natalizumab care au fost testați de JCV ELISPOT, inclusiv cei 2 pacienți cu LMP. Așa cum se arată în Fig. 2F, 53,6% dintre pacienți au fost seropozitivi și 16,1% au fost ELISPOT pozitivi. Douăzeci și șapte la sută dintre pacienții cu JCV-seropozitivi au avut JCV TEM detectabil în sângele lor. Un singur pacient care a fost pozitiv la JCV ELISPOT a fost seronegativ., Potrivit lui Gorelik și colab., rata fals negativă a testului serologic JCV este de 2,5% (17).rezultatele noastre arată că frecvența de detectare a răspunsurilor JCV TEM la pacienții cu SM crește odată cu timpul pe natalizumab. Un studiu anterior a arătat, de asemenea, o creștere a răspunsurilor celulelor T la JCV după 12 luni de tratament cu natalizumab, dar acest studiu a fost limitat la 18 luni de tratament (20), în timp ce am constatat că cea mai puternică creștere a răspunsurilor celulelor T efectoare a avut loc după 24 de luni.,rezultatele noastre indică astfel reactivarea JCV în timpul terapiei cu natalizumab, inclusiv în locurile extrarenale. JCV a fost detectat în creierul persoanelor seronegative HIV fără LMP (21). Diminuat CNS immunosurveillance induse de natalizumab ar putea favoriza locale reactivarea virusului care poate începe ca asimptomatice intermitentă replicarea virusului, dar ar putea evolua spre susținut de replicare a virusului și apoi să LMP. Reactivarea virusului ar putea activa limfocitele T specifice periferice, prin intermediul celulelor prezentatoare de antigen, în locații precum ganglionii limfatici cervicali care drenează creierul (22-24)., Deoarece natalizumab vizează receptorul VLA – 4, Aceste celule specifice nu pot traversa eficient bariera hemato-encefalică și astfel s-ar putea acumula în sânge, facilitând detectarea lor. LMP este, de asemenea, o complicație a infecției cu HIV în stadiu avansat. Dacă detectarea celulelor T efectoare CD4 și CD8 specifice JCV poate preceda LMP asociată cu SIDA este un punct de interes care merită investigații suplimentare. Cu toate acestea, LMP asociată cu SIDA este în mod clar diferită de LMP indusă de natalizumab., Majoritatea pacienților infectați cu HIV care dezvoltă LMP au limfopenie CD4 profundă, care modifică, de asemenea, funcționalitatea celulelor T CD8 prin lipsa ajutorului CD4 (25). În plus, spre deosebire de pacienții tratați cu natalizumab, nu există nici o blocare a traficului de celule T prin bariera hemato-encefalică, iar acest lucru poate preveni acumularea TEM specifică JCV în sânge.împreună, rezultatele noastre sugerează că testele funcționale capabile să detecteze răspunsurile TEM specifice JCV ar putea ajuta la identificarea pacienților cu risc de a dezvolta LMP în timpul tratamentului cu anticorpi care inhibă traficul de limfocite prin bariera hemato-encefalică.,