7.13 F: Secvențierea ADN-ului Bazat pe Sanger Dideoxynucleotides

secvențiere Sanger, de asemenea, cunoscut sub numele de lanț-încetarea de secvențiere, se referă la o metodă de secvențiere a ADN-ului dezvoltat de către Frederick Sanger, în 1977. Această metodă se bazează pe amplificarea fragmentului de ADN care trebuie secvențiat prin ADN polimerază și încorporarea nucleotidelor modificate – în mod specific, dideoxinucleotide (ddNTPs).,

clasic lanț-încetarea metodă necesită un singur-stranded ADN șablon, un ADN primer, ADN polimeraza, normal deoxynucleotidetriphosphates (dNTPs), și a modificat nucleotide (dideoxyNTPs) care termina ADN alungire. Aceste lanț de încheiere nucleotide lipsa unei 3′-OH de grup necesare pentru formarea unei legături phosphodiester între două nucleotide, provocând ADN polimeraza să înceteze extensia de ADN-ul atunci când un ddNTP este încorporată. DdNTPs pot fi etichetate radioactiv sau fluorescent pentru detectarea în mașini automate de secvențiere.,Proba ADN este împărțită în patru reacții de secvențiere separate, conținând toate cele patru deoxinucleotide standard (dATP, dGTP, dCTP și dTTP) și ADN polimeraza. Pentru fiecare reacție este adăugat doar una dintre cele patru dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, sau ddTTP). După runde de extensie a ADN-ului șablon din primerul legat, fragmentele de ADN rezultate sunt denaturate termic și separate prin mărime folosind electroforeza în gel. Acest lucru se realizează frecvent utilizând un gel de poliacrilamidă-uree denaturant, fiecare dintre cele patru reacții desfășurându-se pe una din cele patru benzi individuale (benzile A, T, G, C)., Benzile ADN pot fi apoi vizualizate prin autoradiografie sau lumină UV, iar secvența ADN poate fi citită direct de pe filmul cu raze X sau imaginea cu gel.

variante Tehnice de lanț-încetarea de secvențiere includ marcarea cu nucleotide care conțin fosfor radioactiv pentru marcarea radioactivă, sau folosind un primer etichetat la 5′ end cu un colorant fluorescent. Secvențierea Dye-primer facilitează citirea într-un sistem optic pentru o analiză și automatizare mai rapidă și mai economică. Dezvoltarea ulterioară de către Leroy Hood și colegii de ddNTPs și primeri etichetați fluorescent a stabilit scena pentru secvențierea automată a ADN-ului cu randament ridicat. Metodele de terminare a lanțului au simplificat foarte mult secvențierea ADN-ului., Mai recent, a fost dezvoltată secvențierea colorantului-terminator. Secvențierea Dye-terminator utilizează etichetarea ddNTPs terminator de lanț, care permite secvențierea într-o singură reacție, mai degrabă decât patru reacții ca în metoda etichetată-primer. În secvențierea terminatorilor de coloranți, fiecare dintre cei patru Terminatori ai lanțului dideoxinucleotidic este etichetat cu coloranți fluorescenți, fiecare dintre aceștia emit lumină cu lungimi de undă diferite.,

Automate de secventiere ADN instrumente (secvente de ADN) poate secvență de până la 384 de mostre de ADN într-un singur lot (a alerga), cu până la 24 de curse pe zi., Secvențiatorii ADN efectuează electroforeză capilară pentru separarea dimensiunii, detectarea și înregistrarea fluorescenței colorantului și ieșirea datelor ca cromatograme fluorescente de vârf. Automatizarea a dus la secvențierea genomurilor întregi.