résumé
Trichomonas vaginalis, un protozoaire flagellé, est l’agent causal de la trichomonose, la maladie sexuellement transmissible non virale la plus courante dans le monde. Compte tenu de la prévalence accrue des isolats résistants au métronidazole, des médicaments alternatifs sont essentiels au succès du traitement. Les produits naturels sont la source de la plupart des nouveaux médicaments, et la sagesse populaire sur l’utilisation des plantes médicinales est un outil puissant dans cette recherche., Dans cette étude, l’activité de 10 plantes médicinales largement utilisées dans la vie quotidienne par le groupe indigène Mbyá-Guarani a été évaluée contre sept isolats différents de T. vaginalis. Parmi les extraits aqueux testés, Verveine sp. (Guachu ka’a en langue Mbyá-Guarani) Et Campomanesia xanthocarpa (Guavira en langue Mbyá-Guarani) ont montré l’activité la plus élevée contre T. vaginalis avec une valeur de CMI de 4,0 mg/mL atteignant 100% d’efficacité contre le parasite. Les essais de croissance cinétique ont montré que les extraits favorisaient l’abolition complète de la croissance après 4 h d’incubation., De plus, les extraits testés n’ont pas favorisé une activité hémolytique significative contre les érythrocytes humains. Nos résultats montrent pour la première fois l’activité potentielle de verveine sp. et C. xanthocarpa contre T. vaginalis. De plus, cette étude démontre que les connaissances autochtones sont une source importante de nouveaux prototypes d’agents antiprotozoaires.
1. Introduction
Trichomonas vaginalis parasite le tractus urogénital humain provoquant la trichomonose, la maladie sexuellement transmissible non virale la plus répandue dans le monde, responsable de 248 millions de nouveaux cas par an ., Après la colonisation, le parasite provoque une vaginite, une urétrite et une prostatite . De plus , l’agent pathogène a été associé à des conséquences graves telles que l’issue défavorable de la grossesse et la naissance prématurée , l’infertilité , la prédisposition au cancer du col utérin et la maladie inflammatoire pelvienne . Fait important, la trichomonose agit comme cofacteur dans la transmission et l’acquisition du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Malgré l’impact de cette infection, l’arsenal thérapeutique est restrictif, et seuls le métronidazole et le tinidazole, les deux médicaments 5-nitroimidazole, sont approuvés par la FDA pour le traitement de la trichomonose ., Bien que le taux de guérison soit élevé, un échec du traitement peut être observé et la résistance des isolats de T. vaginalis est la principale raison de l’échec du traitement . En ce sens, il est sans aucun doute nécessaire de rechercher de nouvelles alternatives pour le traitement de la trichomonose et de suivre deux stratégies: (i) la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, ce qui est essentiel au développement rationnel de nouveaux agents antiparasitaires et (ii) la recherche de nouveaux anti-T., vaginalis composés structurellement distincts des 5-nitroimidazoles et, par conséquent, agissant par un mécanisme différent comme démontré par notre groupe .
dans ce contexte, les produits naturels, en particulier les plantes médicinales, sont incommensurables en tant que source puissante de molécules bioactives. Depuis l’Antiquité, les gens utilisent des plantes pour traiter les maladies infectieuses courantes, et certains de ces médicaments traditionnels sont encore intégrés dans le cadre de la guérison de diverses pathologies . En outre, la recherche basée sur des informations ethnopharmacologiques sauve l’immense connaissance empirique de l’utilisation des plantes ., Dans ce contexte, en ce qui concerne l’environnement naturel et la grande richesse des ressources génétiques, le Brésil est un pays d’un grand intérêt pour l’ethnopharmacologie .
Les peuples autochtones disposent d’une mine d’informations sur la biodiversité et savent comment capturer et utiliser les ressources naturelles . Malgré le fait que plusieurs drogues ont été découvertes par le biais de remèdes traditionnels et de connaissances populaires, au Brésil, il existe 122 groupes ethniques autochtones, mais seulement 30% d’entre eux ont été étudiés en ce qui concerne les aspects ethnobotaniques ., Par conséquent, l’étude des plantes utilisées par la médecine autochtone est importante pour interconnecter la médecine traditionnelle et l’environnement biotique en préservant les connaissances anciennes autochtones.
les protozoaires parasites restent une menace majeure pour la santé humaine et animale, et il existe peu de médicaments efficaces pour le traitement de nombreuses maladies protozoaires. En tenant compte de l’ethnopharmacologie indigène en tant que contributeur au dépistage systématique des plantes ayant une activité antiprotozoaire, cette étude a évalué l’anti-T., vaginalis activité des plantes médicinales les plus importantes utilisées dans la médecine indigène Mbyá-Guarani située dans le sud du Brésil.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Conditions de culture du Parasite
dans cette étude, sept isolats de T., vaginalis ont été utilisés: 30236 et 30238 de American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2 et TV-LACM3 (isolats cliniques frais de patientes); TV-LACH1 et TV-LACH2 (isolats cliniques frais de patients masculins) tous de Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Facultdade de Farmácia, UFRGS, Brésil (projet avec approbation éthique par le Comité de recherche éthique). Les trichomonades ont été cultivées axéniquement dans un milieu trypticase-extrait de levure-maltose (TYM) (pH 6,0), complétées par 10% de sérum bovin inactivé par la chaleur et incubées à 37°C.
2.2., Matériel végétal
du matériel végétal a été collecté dans la tribu indigène Mbyá-Guarani située à Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brésil (30°06’47.62″ S et 51°07’37.85″ o), en mars 2011. Ce village est dénommé Tekoá Anhetenguá (en anglais, vrai Village), et 200 personnes vivent dans la région réunis à 40 familles. Les femmes du village ont la connaissance des plantes médicinales utilisées par toute la population et ont effectué la collecte de spécimens. Dix plantes couramment utilisées en médecine indigène pour les maladies infectieuses ont été collectées: feuilles D’Aloe arborescens Mill., (ICN 173371), parties aériennes de Bidens pilosa L. (ICN 167397), parties aériennes de Rhipsalis baccifera (ICN 167402), écorces de Luehea divaricata (ICN 167403), racines de Trichilia sp. (ICN 173126), feuilles de Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), feuilles de coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), feuilles de Citrus limonium (ICN 167399), feuilles de Citrus reticulata (ICN 173127) et feuilles de verveine sp. (CII 167394). Les spécimens de bons ont été déposés à l’herbier de L’Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN).
2.3., Préparation D’extraits de plantes
Les extraits de plantes fraîches ont été préparés conformément à l’utilisation traditionnelle par les peuples autochtones par décoction à 60°C pendant 60 min . Les extraits aqueux ont été lyophilisés et la solution de travail a été préparée à 8,0 mg/mL dans de l’eau ultrapure, stérilisée par filtration (0,22 µm) et stockée à -20°C.
2,4. Dosage Anti-Trichomonas vaginalis
dix extraits aqueux ont été testés in vitro pour vérifier leur activité contre T. vaginalis. Le dosage a été effectué dans 96 plaques de microtitres à la concentration finale de 4,0 mg/mL dans les puits., La concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée à l’aide d’une dilution octuple (4,0–0,031 mg/mL), et la viabilité des trophozoïtes a été déterminée selon une méthode fluorimétrique . Deux contrôles ont été effectués: un contrôle négatif uniquement avec les trophozoïtes et un contrôle positif avec 8,0 µM de métronidazole (Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO, USA). Les expériences ont été réalisées au moins dans trois expériences indépendantes, en trois exemplaires. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de trophozoïtes viables par rapport aux parasites non traités.
2.5., Effet de croissance des extraits aqueux
afin d’étudier l’effet des extraits aqueux actifs sur la croissance de T. vaginalis, une courbe de croissance cinétique a été réalisée à l’aide de L’isolat ATCC 30236. La densité initiale des parasites de 2,0 × 105 trophozoïtes/mL a été incubée avec les extraits à la valeur MIC dans un milieu TYM. Les trophozoïtes ont été comptés à l’aide d’un hémocytomètre pendant 72 H. les résultats ont été exprimés en nombre de trophozoïtes (105/mL)., Pour l’analyse microscopique, les témoins et les parasites traités ont été centrifugés pendant 10 min à 2 000 tr / min pour concentrer les organismes après 4 h d’incubation, et la préparation a été observée au microscope optique (agrandie ×1 000) par exclusion de colorant bleu trypan.
2.6. Analyse hémolytique
Cette analyse a été réalisée selon la méthode utilisée par Rocha et al. . Le groupe sanguin O positif de volontaires humains sains a été recueilli avec la solution D’Alsever (1 : 1) et centrifugé à 2 000 tr / min pendant 5 min. La fraction érythrocytaire a été lavée trois fois avec du PBS 1x (pH 7.,0) et remis en suspension pour donner 1% de suspension de globules rouges (v/v). Les concentrations d’extraits aqueux ont été choisies en fonction de la concentration inhibitrice minimale (CMI) déterminée dans le test de sensibilité. Les érythrocytes ont été incubés avec les extraits à 37°C sous agitation pendant 1 h, puis centrifugés à 3 000 tr / min pendant 5 min. L’absorbance du surnageant a été mesurée à 540 nm. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires et le pourcentage d’hémolyse causé par chaque échantillon testé a été calculé par rapport à 100% d’activité hémolytique de la saponine de Quillaja saponaria .
3., Résultats et Discussion
Cette étude a évalué l’activité anti-T. vaginalis d’extraits aqueux de 10 plantes médicinales utilisées dans le système de Médecine Mbyá-Guarani. Fait important, parmi les plantes testées, nous avons trouvé deux extraits aqueux avec une puissante activité anti-T. vaginalis in vitro. Les extraits prometteurs sont de verveine sp. et Campomanesia xanthocarpa. L’extrait de verveine sp., à 4,0 mg/mL, a démontré l’activité optimale anti-T. vaginalis induisant une cytotoxicité complète (100% de la mort des parasites) sur tous les isolats distincts de trichomonades(Figure 1 (a))., L’extrait de feuilles de Campomanesia xanthocarpa à la même concentration a également montré une activité anti-T. vaginalis très élevée, réduisant la viabilité du parasite jusqu’à 96% (Figure 1(b)).
D’autres extraits aqueux ont donné divers résultats. L’extrait aqueux obtenu à partir de Bidens pilosa a totalement aboli la viabilité des trophozoïtes uniquement de l’isolat 30236 (Figure 1 (c)). L’extrait des écorces de Luehea divaricata induit une réduction différente de la viabilité de T. vaginalis dans chaque isolat de trichomonades testé (Figure 1(d))., Les feuilles de coix lacryma-jobi induisaient, en moyenne, 75% de réduction de viabilité sur les isolats de T. vaginalis; cependant, pour L’isolat TV-LACH2, la réduction n’était que de 40% (Figure 1(e)). Les isolats cliniques frais de patients masculins (TV-LACH1 et TV-LACH2) présentaient une sensibilité plus élevée que les isolats de patients féminins (ATCC et fresh clinical) lorsque L’extrait de racine de Trichilia sp. a été testé (Figure 1(f)). Les extraits de feuilles de Citrus limonium ont réduit d’environ 40% la viabilité des isolats (Figure 1(g))., Les extraits d’Aloe arborescens et de Citrus reticulata ont diminué la viabilité de 50% d’au moins un isolat (Figures 1(h) et 1(i)), tandis que Rhipsalis baccifera n’a réduit que de 30% la viabilité des isolats 30236 et TV-LACM2 (Figure 1(j)).
par rapport aux autres extraits, les extraits de verveine sp. et C. xanthocarpa a démontré l’activité la plus prometteuse contre T. vaginalis, et la concentration inhibitrice minimale a été déterminée pour l’isolat 30236 (Tableau 1).,
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afin d’étudier l’effet de l’extrait le plus actif sur la croissance et la viabilité du parasite, une courbe de croissance cinétique a été réalisée. Le témoin a présenté le pic de croissance classique après 24 h d’incubation; cependant, les organismes traités avec des extraits de verveine sp. et C., xanthocarpa, après 4 h d’incubation, a évoqué une abolition complète de la croissance (Figure 2) et a montré une couleur bleue caractéristique par exclusion de colorant bleu trypan indiquant la mort cellulaire (Figure 3).
Cinétique de croissance de la courbe de Trichomonas vaginalis 30236 isoler après le traitement avec des extraits aqueux de Verveine sp. et Campomanesia xanthocarpa à 4,0 mg / mL. La croissance des trophozoïtes a été complètement inhibée par les extraits en 4 heures d’incubation., Data represent means ± standard deviation of at least three experiments, all in triplicate.
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(C) Campomanesia xanthocarpa
afin d’étudier un effet possible du C. xanthocarpa et de verveine sp., extraits sur la membrane parasitaire et aussi pour avoir des données préliminaires sur la cytotoxicité contre les cellules de mammifères, l’activité hémolytique de ces extraits a été menée. La verveine sp. et les extraits de C. xanthocarpa ont été testés à des valeurs de CMI et ont démontré une lyse des érythrocytes de 6,5 et 7,6%, respectivement (Tableau 1). Ces résultats ont démontré que les deux extraits, aux valeurs de CMI, ne favorisaient pas une activité hémolytique significative, indiquant que le mécanisme d’action responsable de la réduction de la viabilité du parasite n’implique probablement pas de perturbation de la membrane parasitaire., De plus et surtout, ces résultats suggèrent que les deux extraits ne sont pas toxiques pour les cellules de mammifères, car ils n’ont pas lysé les érythrocytes humains.
Cette étude contribue à sauver les connaissances autochtones sur les plantes médicinales. Les Mbyá-Guarani indigènes utilisent Verveine sp. (Guachu ka’a en langue Mbyá-Guarani), comme thé, pour le soulagement des symptômes de maladies infectieuses, telles que la fièvre. Ceci est en accord avec la littérature qui concerne Verbena sp. infusion comme sédatif, analgésique pour les troubles inflammatoires, les brûlures de la peau, l’aménorrhée, la dépression et les maladies gastriques ., De plus, cette espèce a une variété de constituants chimiques, comme les flavonoïdes, les glycosides iridoïdes, les glycosides phénylpropanoïdes, les stérols, les triterpènes et le glycoconjugué, et l’activité biologique peut leur être partiellement attribuée . En outre, cette tribu utilise les feuilles de C. xanthocarpa (Guavira en langue Mbyá-Guarani) pour le traitement de la diarrhée, des douleurs à l’estomac et des vers., Cette plante est traditionnellement utilisée dans le sud du Brésil comme dépuratif, antidiarrhéique, nettoyant et antirhumatismal, et pour diminuer le cholestérol sanguin, et ces propriétés peuvent être attribuées aux tanins , aux saponines et aux flavonoïdes (quercétine, myricétine, quercitrine et rutine), composés présents dans les feuilles de C. xanthocarpa .
l’ethnopharmacologie de sauvetage des utilisations historiques des plantes est reconnue comme précieuse pour la bioprospection, car elle permet de justifier la sélection et la recherche de plantes médicinales ., Cette étude décrit le premier rapport sur l’activité antiprotozoaire de verveine sp. et C. xanthocarpa. De plus, d’autres espèces des familles Verbenaceae et Myrtaceae ont été testées contre T. vaginalis, mais sans succès . Plusieurs biodiversités et connaissances traditionnelles de différentes populations ont guidé les études pour rechercher de nouveaux prototypes anti-T. vaginalis. Récemment, le potentiel des plantes traditionnellement utilisées à partir de Caatinga contre T. vaginalis a été rapporté . Calzada et coll., démontré que les plantes utilisées pour les troubles du tractus urogénital dans la médecine traditionnelle mexicaine ont montré un effet contre ce protozoaire. Les espèces d’Amaryllidaceae utilisées contre les maladies vénériennes en Afrique du Sud ont également montré une activité prometteuse contre T. vaginalis .
compte tenu de l’impact de la trichomonose sur la santé publique et du nombre émergent d’isolats résistants de T. vaginalis, il est nécessaire d’utiliser des alternatives pour le traitement de cette infection. Les produits naturels sont une source prometteuse de molécules actives, et l’approche ethnopharmacologique sauve la connaissance de la population de plantes médicinales., Cette sagesse combinée à des études chimiques et pharmacologiques présente une valeur précieuse dans la bioprospection de médicaments innovants, sûrs et accessibles. Cette étude pionnière a démontré des résultats pertinents sur l’activité anti-T. vaginalis de la verveine sp. et C. xanthocarpa, plantes traditionnellement utilisées par la population indigène Mbyá-Guarani pour les maladies infectieuses. Malgré une forte activité anti-T. vaginalis, ce rapport a sauvé les connaissances des peuples autochtones, évitant la fausse couche de cette sagesse.,
Contribution des auteurs
Clara Lia Costa Brandelli et Patrícia de Brum Vieira ont également contribué à ce travail.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le programme NANOBIOTEC-Brésil du CAPES et du FAPERGS. Les auteurs remercient le chef José Cirilo Pires Morinico (tribu Mbyá-Guarani), pour avoir rendu possible la réalisation de cette étude et pour les informations précieuses. Alexandre José Macedo et Tiana Tasca remercient le CNPq pour ses bourses de recherche.
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