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le Natalizumab, un anticorps utilisé pour traiter la sclérose en plaques récurrente (SEP), empêche le trafic de lymphocytes activés, y compris les lymphocytes autoréactifs, à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le principal effet indésirable du natalizumab est la leucoencéphalopathie multifocale progressive( LEMP), une maladie démyélinisante dévastatrice causée par la réplication du polyomavirus humain JC (JCV) dans les oligodendrocytes et les astrocytes (1, 2)., L’inhibition par le Natalizumab du trafic des lymphocytes T effecteurs du sang vers le système nerveux central (SNC) pourrait favoriser la réplication locale du JCV (3-7).

ici, nous avons examiné la présence de lymphocytes T à mémoire effectrice spécifique au JCV (TEM) dans le sang de patients atteints de SEP après activation overnight de l’antigène ex vivo. In vivo, les nombres TEM spécifiques diminuent une fois que l’antigène apparent est éliminé (8-10), et leur présence peut donc indiquer une réplication continue du JCV. Le TEM libère rapidement des cytokines telles que l’interféron gamma (IFN-γ) lorsqu’il est réexposé à l’antigène., Un test spot immunosorbant enzymatique précédent (ELISPOT) a examiné L’expression de l’IFN-γ dans les lymphocytes T après une activation à long terme avec des peptides JCV pendant 14 jours maximum (11). Cependant, l’activation prolongée permet à la mémoire des lymphocytes T quiescents à long terme d’être réactivée et de se développer, ce qui signifie qu’une réponse positive ne signifie pas nécessairement une réponse immunitaire continue. Ici, nous avons d’abord examiné la présence de TEM spécifique au JCV chez deux patients atteints de SEP qui ont développé une LMP. Le premier patient a reçu un diagnostic de LEMP après 39 mois sous natalizumab (39 perfusions) (service de Neurologie, Hôpital de la Pitié-Salpétrière)., Elle était âgée de 39 ans et avait 10 ans d’antécédents de rémission récurrente de la SEP.avant le natalizumab, elle avait reçu du cyclophosphamide et de la mitoxantrone. La LEMP a été confirmée par IRM et PCR JCV sur le liquide céphalo-rachidien (LCR). Lorsqu’elle a été testée pour la GFT spécifique au JCV, 8 semaines après l’apparition des symptômes de la LMP, elle avait 1 040 copies du génome du JCV par ml de LCR (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Ses cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été activées in vitro en milieu AIM-V et Albumax (Invitrogen) pendant 16 h avec du JCV purifié (souche MAD-4; LGC Promochem; 104,5 dose infectieuse de culture tissulaire à 50% /0,2 ml)., Aucune interleukine 2 recombinante (IL-2) n’a été ajoutée. Une quantité de virus correspondant à 5 534 PFU a été ajoutée à chaque puits. Cela correspondait à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,02. Les cellules ont ensuite été testées pour L’IFN-γ intracellulaire par cytométrie en flux. La mortalité cellulaire après activation pendant la nuit était inférieure à 5%. Comme indiqué dans la Fig. Les cellules répondantes 1A et andB,B ont été détectées dans les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 et CD8, et la plupart d’entre elles présentaient le phénotype CCR7− CD45RA caractéristique des effecteurs de mémoire (12)., Les TEM Anti-JCV ont également été détectés par IFN-γ ELISPOT (anticorps de capture et de détection, clones 1-D1 et K7-B6-1, respectivement; Mabtech) après 16 h d’activation avec des peptides JCV ou VP-1 purifiés (un mélange de 14 pools de peptides de 15 acides aminés superposés recouvrant la totalité de la protéine JCV VP-1 ) (Fig. 1C). La deuxième patiente était âgée de 46 ans et avait des antécédents de SEP récurrente-rémittente depuis 11 ans.avant le natalizumab, elle avait reçu de l’interféron bêta, de l’acétate de glatiramer, de l’azathioprine et de la mitoxantrone. Elle a été dirigée vers le Tenon Hospital MS center pour une réévaluation après 24 perfusions de natalizumab., Une IRM cérébrale réalisée en mai 2012 a détecté une petite lésion suspecte linéaire T2-hyperintense dans la région frontale droite juxtacorticale. Le premier échantillon du LCR était négatif pour le JCV. Une IRM répétée après le retrait du natalizumab a révélé une augmentation de la taille de la lésion, conduisant à deux autres examens du LCR, tous deux négatifs pour le JCV. La PCR JCV sur plasma a été réalisée 2 et 4 mois après le début de la LMP. Les deux échantillons de plasma étaient négatifs. Une biopsie cérébrale réalisée en septembre 2012 a finalement confirmé le diagnostic de LEMP.,

L’analyse ELISPOT de la réponse IFN-γ AU JCV, réalisée 2 jours après la dernière perfusion de natalizumab, a montré la présence de TEM spécifique au JCV dans le sang (Fig. 1C). Fait intéressant, les nombres de TEM spécifiques au JCV circulants étaient plus faibles que chez le premier patient atteint de LEMP, qui pouvait avoir eu un niveau plus élevé de réplication du JCV dans le cerveau, car la PCR du JCV sur le LCR était positive chez le premier patient et négative chez le second.,

Nous avons également examiné la présence de TEM spécifique au JCV par ELISPOT dans une série de 62 patients atteints de SEP avec SEP rémittente récurrente traités par natalizumab selon les termes de commercialisation européenne, ainsi que chez 35 patients atteints de SEP qui ne recevaient aucun traitement modificateur de la maladie, et un groupe de 40 donneurs sains appariés pour l’âge et le sexe avec des patients atteints de SEP. Les caractéristiques des patients atteints de SEP sont présentées dans le tableau 1. Les patients et donneurs sains ont donné leur accord écrit pour participer à l’étude, qui a été approuvée par le Comité d’éthique de L’Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, à Paris., Une réponse ELISPOT était considérée comme positive si le nombre corrigé de taches (nombre de taches dans les puits activés moins nombre de taches dans les puits non traités) était d’au moins 10, avec moins de 10 taches dans les puits non traités.

la proportion d’échantillons positifs était de 2,5% chez les donneurs sains (fig. 2A). Dans le Groupe SP, le pourcentage de patients positifs a augmenté avec le temps passé sous natalizumab (Fig. 2B et etc), C), de 8,8% chez les patients atteints de SEP non traités à 15,9% chez les patients traités par natalizumab depuis moins de 24 mois et 27% chez les patients traités depuis plus de 24 mois (Fig., 2C) (significatif pour les patients traités pendant plus de 24 mois par rapport à la SEP non traitée et par rapport aux sujets témoins ). Cette augmentation de la fréquence de détection des réponses TEM au JCV suggère que le traitement prolongé au natalizumab favorise la réactivation du JCV.

Un sous-ensemble de patients traités au natalizumab a été échantillonné au moins deux fois (Voir tableau 1). Comme indiqué dans la Fig. 2D, la plupart de ces patients sont devenus positifs ou sont restés positifs pendant la période d’échantillonnage.,

Le rein est un réservoir important pour le JCV. Un pourcentage significatif de la population générale excrète le virus dans son urine, mais n’a aucune preuve de JCV dans son sang (13-15). De plus, la présence d’ADN JCV dans le cerveau semble indépendante de sa présence dans le rein (16). Comme indiqué dans la Fig. 2E, 60% des patients atteints de SEP ayant une TEM JCV détectable dans le sang n’avaient pas de TEM JCV détectable dans leurs urines, et 69% des patients ayant une PCR JCV positive dans leurs urines n’avaient pas de TEM JCV détectable. L’excrétion urinaire du JCV sans TEM JCV détectable a également été observée chez les donneurs sains (Fig. 2E)., Ceci suggère que la présence de la réplication du JCV dans le rein ne mène pas nécessairement au TEM détectable de JCV dans le sang. Inversement, cela soulève la possibilité que la détection de TEM JCV dans le sang puisse refléter la réplication extrarénale continue du JCV.

dans une étude utilisant une nouvelle méthode ELISA (JCV enzyme-linked immunosorbent assay) (17), la séroprévalence estimée du JCV chez les patients atteints de SEP traités par natalizumab était de 53,6% (17). La séropositivité n’est pas nécessairement corrélée à la présence de réponses TEM, qui est liée à la réactivation du virus., Les plasmocytes à longue durée de vie peuvent persister dans la moelle osseuse pendant de longues périodes, peut-être pendant des décennies, en maintenant des titres d’anticorps sériques soutenus sans réplication Active de l’agent pathogène (18, 19). Nous avons utilisé la même méthode ELISA pour tester 56 de nos patients atteints de SEP traités au natalizumab qui avaient été testés par JCV ELISPOT, y compris les 2 patients atteints de LEMP. Comme indiqué dans la Fig. 2F, 53,6% des patients étaient séropositifs et 16,1% étaient positifs à ELISPOT. Vingt-sept pour cent des patients séropositifs au JCV avaient une TEM détectable au JCV dans leur sang. Un seul patient qui était positif à JCV ELISPOT était séronégatif., Selon Gorelik et coll., le taux de faux négatif du test sérologique JCV est de 2,5% (17).

nos résultats montrent que la fréquence de détection des réponses TEM JCV chez les patients atteints de SEP augmente avec le temps passé sous natalizumab. Une étude précédente a également montré une augmentation des réponses des lymphocytes T au JCV après 12 mois de traitement par le natalizumab, mais cette étude a été limitée à 18 mois de traitement (20), alors que nous avons constaté que la plus forte augmentation des réponses des lymphocytes T effecteurs a eu lieu après 24 mois.,

nos résultats indiquent donc une réactivation du JCV pendant le traitement par le natalizumab, y compris dans les sites extrarénaux. Le JCV a été détecté dans le cerveau de personnes séronégatives sans LEMP (21). La diminution de l’immunosurveillance du SNC induite par le natalizumab pourrait favoriser la réactivation locale du virus qui pourrait commencer par une réplication intermittente asymptomatique du virus, mais pourrait évoluer vers une réplication prolongée du virus, puis vers la LMP. La réactivation du Virus pourrait activer des lymphocytes T spécifiques périphériques, via des cellules présentant l’antigène, dans des endroits tels que les ganglions lymphatiques cervicaux drainant le cerveau (22-24)., Comme le natalizumab cible le récepteur VLA-4, ces cellules spécifiques ne peuvent pas traverser efficacement la barrière hémato-encéphalique et pourraient ainsi s’accumuler dans le sang, facilitant ainsi leur détection. La LEMP est également une complication de l’infection par le VIH à un stade avancé. La question de savoir si la détection des lymphocytes T CD4 et CD8 effecteurs spécifiques du JCV peut précéder la LMP associée au SIDA est un point d’intérêt qui mérite une enquête plus approfondie. Cependant, la LMP associée au SIDA est clairement différente de la LMP induite par le natalizumab., La plupart des patients infectés par le VIH qui développent une LMP ont une lymphopénie CD4 profonde, qui modifie également la fonctionnalité des lymphocytes T CD8 par le manque d’aide CD4 (25). De plus, contrairement aux patients sous natalizumab, il n’y a pas de blocage du trafic des lymphocytes T à travers la barrière hémato-encéphalique, ce qui peut empêcher l’accumulation de TEM spécifique au JCV dans le sang.

ensemble, nos résultats suggèrent que des tests fonctionnels capables de détecter les réponses TEM spécifiques au JCV pourraient aider à identifier les patients à risque de développer une LEMP pendant le traitement avec des anticorps qui inhibent le trafic lymphocytaire à travers la barrière hémato-encéphalique.,