PMC (Polski)

tekst

Natalizumab, przeciwciało stosowane w leczeniu nawracającej stwardnienia rozsianego (MS), zapobiega przemytowi aktywowanych limfocytów, w tym limfocytów autoreaktywnych, przez barierę krew-mózg (BBB). Głównym działaniem niepożądanym natalizumabu jest postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia( PML), niszczycielska choroba demielinizacyjna spowodowana replikacją ludzkiego poliomawirusa JC (JCV) u oligodendrocytów i astrocytów (1, 2)., Natalizumab hamowanie efektorowego handlu komórkami T z krwi do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) może sprzyjać lokalnej replikacji JCV (3-7).

zbadano obecność komórek T z pamięcią efektorową specyficzną dla JCV (tem) we krwi pacjentów z SM po nocnej aktywacji antygenu ex vivo. In vivo, swoiste TEM numbers zmniejszać gdy cognate antygen jest oczyszczony (8-10), i ich obecność może zatem wskazywać na trwającą JCV replikację. TEM szybko uwalniają cytokiny, takie jak interferon gamma (IFN-γ), gdy są reeksponowane do antygenu., W poprzednim teście immunosorbentów enzymatycznych (ELISPOT) badano ekspresję IFN-γ w komórkach T po długotrwałej aktywacji peptydami JCV przez okres do 14 dni (11). Jednak przedłużona aktywacja pozwala na reaktywację i rozszerzenie długotrwałej, cichej pamięci limfocytów T, co oznacza, że pozytywna odpowiedź niekoniecznie oznacza trwającą odpowiedź immunologiczną. Tutaj najpierw zbadano obecność specyficznego dla JCV TEM u dwóch pacjentów z SM, u których rozwinął się PML. U pierwszego pacjenta rozpoznano PML po 39 miesiącach leczenia natalizumabem (39 wlewów) (oddział neurologii, Szpital Pitié-Salpétrière)., Miała 39 lat i 10-letnią historię nawracającego stwardnienia rozsianego. przed zastosowaniem natalizumabu otrzymywała cyklofosfamid i mitoksantron. PML zostało potwierdzone MRI i JCV PCR na płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). W badaniu na obecność TEM swoistego dla JCV, 8 tygodni po wystąpieniu objawów PML, miała 1040 kopii genomu JCV na ml płynu mózgowo-rdzeniowego (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) były aktywowane in vitro w pożywce aim-V i Albumax (Invitrogen) przez 16 godzin oczyszczonym JCV (szczep MAD-4; LGC Promochem; 104,5 dawka zakaźna 50% hodowli tkankowej /0,2 ml)., Nie dodano rekombinowanej interleukiny 2 (IL-2). Do każdej studni dodano ilość wirusa odpowiadającą 5534 PFU. Odpowiadało to mnogości infekcji (MOI) wynoszącej 0,02. Komórki były następnie badane na obecność wewnątrzkomórkowego IFN-γ za pomocą cytometrii przepływowej. Śmiertelność komórek po aktywacji nocnej wynosiła mniej niż 5%. Jak pokazano na Rys. 1A i andB,B, reagujące komórki zostały wykryte zarówno w podgrupach limfocytów T CD4, jak i CD8, a większość z nich miała fenotyp CCR7-CD45RA charakterystyczny dla efektorów pamięci (12)., TEM anty-JCV zostały również wykryte przez IFN-γ ELISPOT (przeciwciała wychwytujące i wykrywające, klony 1-D1 i K7-B6-1, odpowiednio; Mabtech) po 16 h aktywacji oczyszczonymi peptydami JCV lub VP-1 (mieszanka 14 pul nakładających się 15-aminokwasowych peptydów pokrywających całe białko JCV VP-1) (rys. 1C). Druga pacjentka miała 46 lat i 11-letni wywiad z nawracającym stwardnieniem rozsianym. przed rozpoczęciem leczenia natalizumabem otrzymywała interferon beta, octan glatirameru, azatioprynę i mitoksantron. Po 24 wlewach natalizumabu skierowano ją do szpitala Tenon Hospital MS center w celu dokonania ponownej oceny., MRI mózgu wykonane w maju 2012 roku wykryło małe, liniowe, hiperintensywne uszkodzenie T2 W prawym obszarze czołowym. Pierwsza próbka CSF była ujemna dla JCV. Powtarzany rezonans magnetyczny po odstawieniu natalizumabu wykazał wzrost wielkości zmian, co doprowadziło do dwóch kolejnych badań płynu mózgowo-rdzeniowego, z których oba były ujemne dla JCV. JCV PCR w osoczu wykonywano 2 i 4 miesiące po wystąpieniu PML. Obie próbki osocza były negatywne. Biopsja mózgu wykonana we wrześniu 2012 ostatecznie potwierdziła diagnozę PML.,

analiza ELISPOT odpowiedzi IFN-γ na JCV, przeprowadzona 2 dni po ostatnim wlewie natalizumabu, wykazała obecność specyficznego dla JCV TEM we krwi (rys. 1C). Co ciekawe, krążące liczby TEM specyficzne dla JCV były niższe niż u pierwszego pacjenta z PML, który mógł mieć wyższy poziom replikacji JCV w mózgu, ponieważ JCV PCR w płynie mózgowo-rdzeniowym był dodatni u pierwszego pacjenta i ujemny u drugiego.,

zbadaliśmy również obecność specyficznego dla JCV TEM przez ELISPOT w serii 62 pacjentów z stwardnieniem rozsianym z nawracającym stwardnieniem rozsianym leczonych natalizumabem zgodnie z europejskimi warunkami marketingowymi, a także u 35 pacjentów z stwardnieniem rozsianym, którzy nie otrzymywali żadnej terapii modyfikującej przebieg choroby, oraz w grupie 40 zdrowych dawców dopasowanych pod względem wieku i płci z pacjentami z stwardnieniem rozsianym. Charakterystyka pacjentów z SM przedstawiono w tabeli 1. Pacjenci i zdrowi dawcy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu, która została zatwierdzona przez Komisję Etyczną szpitala Pitié-Salpêtrière w Paryżu., Odpowiedź ELISPOT uznano za pozytywną, jeżeli skorygowana liczba plamek (liczba plamek w studzienkach aktywowanych minus liczba plamek w studzienkach nieleczonych) wynosiła co najmniej 10, przy czym liczba plamek w studzienkach nieleczonych wynosiła mniej niż 10.

odsetek próbek dodatnich wyniósł 2,5% u zdrowych dawców (rys. 2A). W grupie SM odsetek pacjentów z dodatnim wynikiem wzrastał wraz z czasem leczenia natalizumabem (rys. 2B i andC), C), od 8,8% u nieleczonych pacjentów z SM do 15,9% u pacjentów leczonych natalizumabem przez okres krótszy niż 24 miesiące i 27% u pacjentów leczonych dłużej niż 24 miesiące (ryc., 2C) (istotne dla pacjentów leczonych dłużej niż 24 miesiące w porównaniu z nieleczonym SM i w porównaniu z osobami z grupy kontrolnej). Ten wzrost częstości wykrywania odpowiedzi tem JCV sugerował, że przedłużone leczenie natalizumabem sprzyjało reaktywacji JCV.

przynajmniej dwukrotnie pobrano próbki z grupy pacjentów leczonych natalizumabem (patrz Tabela 1). Jak pokazano na Rys. 2D, większość z tych pacjentów albo stała lub pozostała dodatnia w okresie pobierania próbek.,

nerka jest głównym rezerwuarem dla JCV. Znaczny odsetek populacji ogólnej wydala wirusa w moczu, ale nie ma dowodów na obecność JCV we krwi (13-15). Ponadto obecność JCV DNA w mózgu wydaje się być niezależna od jego obecności w nerkach (16). Jak pokazano na Rys. 2E, 60% pacjentów ze stwardnieniem rozsianym z wykrywalnym JCV TEM we krwi nie miało wykrywalnego JCV w moczu, a 69% pacjentów z dodatnim JCV PCR w moczu nie miało wykrywalnego JCV tem. Wydalanie JCV z moczem bez wykrywalnego JCV TEM obserwowano również u zdrowych dawców (ryc. 2E)., Sugeruje to, że obecność replikacji JCV w nerkach niekoniecznie prowadzi do wykrywalnego JCV TEM we krwi. Z drugiej strony, Zwiększa to możliwość, że wykrywanie TEM JCV we krwi może odzwierciedlać trwającą pozarenalną replikację JCV.

w badaniu z zastosowaniem nowej metody testu immunosorbentu enzymatycznego JCV (ELISA) (17), szacowana seroprewalencja JCV u pacjentów z SM leczonych natalizumabem wynosiła 53,6% (17). Seropozytywność niekoniecznie koreluje z obecnością odpowiedzi TEM, co jest związane z reaktywacją wirusa., Długotrwałe komórki osocza mogą utrzymywać się w szpiku kostnym przez długi czas, być może przez dziesięciolecia, utrzymując trwałe miana przeciwciał w surowicy bez aktywnej replikacji patogenu (18, 19). Tą samą metodą ELISA przetestowaliśmy 56 naszych pacjentów z SM leczonych natalizumabem, którzy byli testowani przez JCV ELISPOT, w tym 2 pacjentów z PML. Jak pokazano na Rys. 2F, 53,6% pacjentów było seropozytywnych, a 16,1% było ELISPOT dodatnich. U dwudziestu siedmiu procent pacjentów seropozytywnych z JCV wykryto we krwi tem JCV. Tylko jeden pacjent z dodatnim wynikiem JCV ELISPOT był seronegatywny., Według Gorelika i wsp., odsetek fałszywie ujemnych wyników testu serologicznego JCV wynosi 2,5% (17).

nasze wyniki pokazują, że częstotliwość wykrywania odpowiedzi JCV TEM u pacjentów z SM wzrasta wraz z czasem leczenia natalizumabem. Poprzednie badanie wykazało również wzrost odpowiedzi limfocytów T na JCV po 12 miesiącach leczenia natalizumabem, ale badanie to było ograniczone do 18 miesięcy leczenia (20), podczas gdy okazało się, że najsilniejszy wzrost odpowiedzi limfocytów T efektorowych wystąpił po 24 miesiącach.,

nasze wyniki wskazują więc na reaktywację JCV podczas leczenia natalizumabem, w tym w miejscach pozanerczowych. JCV został wykryty w mózgu osób seronegatywnych HIV bez PML (21). Zmniejszona Kontrola immunologiczna OUN wywołana przez natalizumab może sprzyjać lokalnej reaktywacji wirusa, która może rozpocząć się jako bezobjawowa przerywana replikacja wirusa, ale może ewoluować w kierunku trwałej replikacji wirusa, a następnie do PML. Reaktywacja wirusa może aktywować obwodowe swoiste limfocyty T, poprzez komórki prezentujące antygen, w miejscach takich jak wysuszające mózg węzły chłonne szyjne (22-24)., Ponieważ natalizumab celuje w receptor VLA-4, te specyficzne komórki nie mogą skutecznie przekroczyć bariery krew-mózg i w ten sposób mogą gromadzić się we krwi, ułatwiając ich wykrywanie. PML jest również powikłaniem późnego stadium zakażenia HIV. To, czy wykrycie specyficznych dla JCV komórek T efektorowych CD4 i CD8 może poprzedzać PML związane z AIDS, jest punktem zainteresowania, który zasługuje na dalsze badania. Jednakże PML związany z AIDS wyraźnie różni się od PML indukowanego natalizumabem., Większość pacjentów zakażonych HIV, u których rozwija się PML, ma głęboką limfopenię CD4, która również zmienia funkcjonalność limfocytów T CD8 poprzez brak pomocy CD4 (25). Ponadto, w przeciwieństwie do pacjentów leczonych natalizumabem, nie ma blokady przemytu limfocytów T przez barierę krew-mózg, co może zapobiec kumulacji tem specyficznej dla JCV we krwi.

razem nasze wyniki sugerują, że testy funkcjonalne zdolne do wykrywania odpowiedzi tem specyficznych dla JCV mogą pomóc w identyfikacji pacjentów z ryzykiem rozwoju PML podczas leczenia przeciwciałami, które hamują handel limfocytami przez barierę krew-mózg.,