Streszczenie
Trichomonas vaginalis, pierwotniak wiciowy, jest czynnikiem sprawczym trichomonosis, najczęstszej niewirusowej choroby przenoszonej drogą płciową na całym świecie. Biorąc pod uwagę zwiększoną częstość występowania izolatów opornych na metronidazol, alternatywne leki są niezbędne do skutecznego leczenia. Naturalne produkty są źródłem większości nowych leków, a popularna mądrość na temat stosowania roślin leczniczych jest potężnym narzędziem w tym poszukiwaniu., W badaniu tym oceniono aktywność 10 roślin leczniczych szeroko stosowanych w życiu codziennym przez rdzenną grupę Mbyá-Guarani wobec siedmiu różnych izolatów T. vaginalis. Wśród badanych ekstraktów wodnych Verbena Sp. (Guachu ka ' a w języku Mbyá-Guarani) i Campomanesia xanthocarpa (Guavira w języku Mbyá-Guarani) wykazały najwyższą aktywność przeciwko T. vaginalis o wartości MIC 4,0 mg / mL osiągając 100% skuteczności przeciwko pasożytowi. Testy wzrostu kinetycznego wykazały, że ekstrakty promowały całkowite zniesienie wzrostu po 4 godzinach inkubacji., Ponadto badane ekstrakty nie promowały znaczącej aktywności hemolitycznej przeciwko ludzkim erytrocytom. Nasze wyniki po raz pierwszy pokazują potencjalną działalność Verbena Sp. i C. xanthocarpa przeciwko T. vaginalis. Ponadto badanie to pokazuje, że lokalna wiedza jest ważnym źródłem nowych prototypowych środków przeciwpierwotnych.
1. Wprowadzenie
Trichomonas vaginalis pasożytuje na ludzkim przewodzie moczowo-płciowym, powodując trichomonozę, najbardziej rozpowszechnioną niewirusową chorobę przenoszoną drogą płciową na świecie, odpowiedzialną za 248 milionów nowych przypadków rocznie ., Po kolonizacji pasożyt powoduje zapalenie pochwy, zapalenie cewki moczowej i zapalenie gruczołu krokowego . Co więcej, patogen wiąże się z poważnymi konsekwencjami, takimi jak niekorzystne wyniki ciąży i poród przedwczesny, niepłodność , predyspozycje do raka szyjki macicy i zapalenie narządów miednicy mniejszej . Co ważne, trichomonosis działa jako kofaktor w przenoszeniu i nabywaniu ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Pomimo wpływu tej infekcji, arsenał terapeutyczny jest ograniczony i tylko metronidazol i tinidazol, oba leki 5-nitroimidazolowe, są zatwierdzone przez FDA do leczenia trichomonozy ., Chociaż szybkość utwardzania jest wysoka, można zaobserwować niepowodzenie leczenia, a oporność izolatów T. vaginalis jest główną przyczyną niepowodzenia leczenia . W tym sensie bez wątpienia konieczne jest, aby można było przeprowadzić badanie nowych alternatyw dla leczenia rzęsistkowica i dwie strategie: (i) poszukiwanie nowych celów terapeutycznych, co jest niezbędne do racjonalnego rozwoju nowych leków przeciwpasożytniczych oraz (ii) badanie nowych leków przeciwt., związki vaginalis strukturalnie różnią się od 5-nitroimidazoli i w konsekwencji działają według innego mechanizmu, o czym świadczy nasza grupa .
w tym kontekście produkty naturalne, zwłaszcza rośliny lecznicze, są niezmierzone jako silne źródło bioaktywnych cząsteczek. Od czasów starożytnych ludzie używają roślin do leczenia powszechnych chorób zakaźnych, a niektóre z tych tradycyjnych leków są nadal zintegrowane w ramach leczenia różnych patologii . Ponadto, wyszukiwanie oparte na Informacji etnofarmakologicznych ratuje ogromną empiryczną wiedzę o wykorzystaniu roślin ., W tym kontekście, jeśli chodzi o środowisko naturalne i ogromne bogactwo zasobów genetycznych, Brazylia jest krajem bardzo interesującym dla etnofarmakologii .
rdzenni mieszkańcy mają bogactwo informacji o różnorodności biologicznej i wiedzą, jak przechwytywać i wykorzystywać zasoby naturalne . Pomimo faktu, że kilka narkotyków zostało odkrytych dzięki tradycyjnym lekarstwom i wiedzy ludowej, w Brazylii istnieją 122 rdzenne grupy etniczne, ale tylko 30% z nich zostało zbadanych pod względem etnobotanicznych aspektów ., Dlatego badanie roślin wykorzystywanych przez medycynę rdzenną jest ważne dla połączenia tradycyjnej medycyny i środowiska biotycznego, zachowując rdzenną wiedzę starożytną.
pasożytnicze pierwotniaki pozostają poważnym zagrożeniem dla zdrowia ludzi i zwierząt, a niewiele jest skutecznych leków w leczeniu wielu chorób pierwotniaków. Biorąc pod uwagę rdzenną etnofarmakologię jako wkład w systematyczne badania przesiewowe roślin o aktywności antyprotozoalnej, w badaniu tym oceniono anty-T., vaginalis aktywność najważniejszych roślin leczniczych stosowanych w mbyá-Guarani medycyny lokalnej znajduje się w południowej Brazylii.
2. Materiały i metody
2.1. Warunki hodowli pasożytów
w tym badaniu siedem izolatów T., vaginalis zostały użyte: 30236 i 30238 z American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2 i TV-LACM3 (świeże Izolaty kliniczne od kobiet); TV-LACH1 i TV-LACH2 (świeże Izolaty kliniczne od mężczyzn) wszystkie z Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brazylia (projekt z zatwierdzeniem etycznym przez UFRGS Ethical Research Committee, numer 18923). Trichomonady hodowano aksenicznie w pożywce trypticase-drożdże extract-maltose (TYM) (pH 6,0), uzupełniono 10% surowicą bydlęcą inaktywowaną termicznie i inkubowano w temperaturze 37°C.
2.2., Materiał roślinny
materiał roślinny został zebrany od rdzennego plemienia Mbyá-Guarani znajdującego się w Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brazylia (30°06’47.62″ s i 51°07’37.85″ W), W marcu 2011. Wieś ta nosi nazwę Tekoá Anhetenguá( po angielsku prawdziwa wieś), a w okolicy mieszka 200 osób skupionych w 40 rodzinach. Kobiety ze wsi posiadają wiedzę o roślinach leczniczych wykorzystywanych przez całą ludność i prowadziły zbiórkę okazów. Zebrano dziesięć roślin rutynowo wykorzystywanych w medycynie miejscowej chorób zakaźnych: liście aloesu arborescens Mill., (ICN 173371), części ANTENOWE Bidens pilosa L. (ICN 167397), części ANTENOWE Rhipsalis baccifera (ICN 167402), szczeki Luehea divaricata (ICN 167403), korzenie Trichilia Sp. (ICN 173126), leaves of Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), liście Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), liście Citrus limonium (ICN 167399), liście Citrus reticulata (ICN 173127) oraz liście Verbena Sp. (ICN 167394) Okazy bonów zostały zdeponowane w herbarium Universidade Federal do Rio Grande Do Sul (ICN).
2.3., Przygotowanie ekstraktów roślinnych
świeże ekstrakty roślinne zostały przygotowane zgodnie z tradycyjnym zastosowaniem przez tubylców przez wywar w temperaturze 60°C przez 60 min . Ekstrakty wodne liofilizowano, a roztwór roboczy przygotowywano w temperaturze 8,0 mg/mL w ultraczystej wodzie, sterylizowano przez filtrację (0,22 µm) i przechowywano w temperaturze -20°C.
2,4. Test anty-Trichomonas vaginalis
dziesięć wodnych ekstraktów zostało przesiewanych in vitro pod kątem aktywności przeciwko T. vaginalis. Badanie przeprowadzono na 96 płytkach mikrotiterowych w końcowym stężeniu 4,0 mg / mL w studzienkach., Minimalne stężenie hamujące (Mic) oznaczono przy użyciu ośmiokrotnego rozcieńczenia (4,0–0,031 mg/mL), a żywotność trofozoitów oznaczono metodą fluorymetryczną . Przeprowadzono dwie kontrole: kontrolę negatywną tylko trofozoitami i kontrolę pozytywną metronidazolem 8,0 µM (Sigma Chemical Co ., St. Louis, MO, USA). Eksperymenty przeprowadzono co najmniej w trzech niezależnych eksperymentach, w trzech egzemplarzach. Wyniki zostały wyrażone jako odsetek żywotnych trofozoitów w porównaniu do nieleczonych pasożytów.
2.5., Efekt wzrostu ekstraktów wodnych
w celu zbadania wpływu aktywnych ekstraktów wodnych na wzrost T. vaginalis, przeprowadzono kinetyczną krzywą wzrostu przy użyciu izolatu ATCC 30236. Pasożyty o gęstości początkowej 2,0 × 105 trofozoitów / mL inkubowano z ekstraktami o wartości MIC w pożywce TYM. Trofozoity były liczone za pomocą hemocytometru w ciągu 72 godzin. wyniki były wyrażone jako liczba trofozoitów (105 / mL)., W celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej pasożyty kontrolne i poddane działaniu środka były odwirowane przez 10 min przy 2000 obr. / min w celu zagęszczenia organizmów po 4 godzinach inkubacji, a preparat obserwowano w mikroskopie świetlnym (powiększonym ×1000) poprzez wykluczenie trypanu z niebieskiego barwnika.
2.6. Test hemolityczny
ten test przeprowadzono zgodnie z metodą stosowaną przez Rocha i wsp. . Grupę krwi o dodatnią od zdrowych ochotników ludzkich pobrano roztworem Alsever (1: 1) i odwirowywano z prędkością 2000 obr. / min przez 5 min. Frakcję erytrocytów przemyto trzykrotnie PBS 1x (pH 7.,0) i wymieszać w celu uzyskania 1% zawiesiny krwinek czerwonych (v/v). Stężenia ekstraktów wodnych wybrano zgodnie z minimalnym stężeniem hamującym (Mic) określonym w teście wrażliwości. Erytrocyty inkubowano z ekstraktami w temperaturze 37°C w trakcie mieszania przez 1 godzinę, a następnie odwirowywano z prędkością 3000 obr. / min przez 5 minut. Absorbancja supernatantu została zmierzona przy 540 nm. Eksperyment przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a procent hemolizy wywołanej przez każdą badaną próbkę obliczono w porównaniu do 100% aktywności hemolitycznej saponiny z Quillaja saponaria .
3., Wyniki i dyskusja
w tym badaniu oceniono aktywność przeciw T. vaginalis wodnych ekstraktów z 10 roślin leczniczych stosowanych w medycynie System Mbyá-Guarani. Co ważne, wśród badanych roślin znaleźliśmy dwa wodne ekstrakty o silnym działaniu anty-T. vaginalis in vitro. Obiecujące ekstrakty są z Verbena Sp. i Campomanesia xanthocarpa. Wyciąg z Verbena Sp. w dawce 4,0 mg/mL wykazano optymalną aktywność anty-T. vaginalis wywołującą całkowitą cytotoksyczność (100% śmierci pasożytów) na wszystkich izolatach trichomonads (ryc. 1(A))., Ekstrakt z liści Campomanesia xanthocarpa w tym samym stężeniu wykazał również bardzo wysoką aktywność anty-T. vaginalis, zmniejszając żywotność pasożyta do 96% (Rysunek 1(b)).
inne ekstrakty wodne wyświetlały różne wyniki. Wodny ekstrakt otrzymany z Bidens pilosa całkowicie zniósł żywotność trofozoitów tylko izolatu 30236 (Rysunek 1(c)). Ekstrakt szczeka luehea divaricata wywołał zmniejszenie żywotności T. vaginalis w różny sposób w każdym testowanym izolacie trichomonads (ryc. 1(d))., Liście Coix lacryma-jobi powodowały przeciętnie 75% redukcję żywotności izolatów T. vaginalis; jednak dla izolatu TV-LACH2 redukcja wynosiła tylko 40% (ryc. 1(e)). Świeże Izolaty kliniczne od pacjentów męskich (TV-LACH1 i TV-LACH2) wykazywały większą wrażliwość niż Izolaty od pacjentów żeńskich (ATCC i fresh clinical), gdy ekstrakt z korzenia Trichilia sp. zostało przebadane (Rys. 1 (f)). Ekstrakty z liści cytrusowych limonium zmniejszyły żywotność izolatów o około 40% (ryc. 1 (g))., Ekstrakty z Aloe arborescens i Citrus reticulata zmniejszyły żywotność co najmniej 50% co najmniej jednego izolatu( ryc. 1 (h) i 1(i)), podczas gdy Rhipsalis baccifera zmniejszyła żywotność tylko o 30% izolatów 30236 i TV-LACM2 (ryc. 1(j)).
w porównaniu do innych wyciągów, wyciągi z Verbena sp. C. xanthocarpa wykazała najbardziej obiecującą aktywność przeciwko T. vaginalis, a minimalne stężenie hamujące określono dla izolatu 30236 (Tabela 1).,
|
|||||||||||||||||||||
w celu zbadania wpływu najbardziej aktywnego ekstraktu na wzrost i żywotność pasożytów, wykonano krzywą kinetyczną wzrostu. Kontrola wykazała klasyczny szczyt wzrostu po 24 h inkubacji; jednak organizmy poddane działaniu ekstraktów z Verbena sp. i C., xanthocarpa, po 4 godzinach inkubacji, wywołała całkowite zniesienie wzrostu (ryc. 2) i wykazała charakterystyczny niebieski kolor poprzez wykluczenie trypanowego niebieskiego barwnika wskazującego na śmierć komórki (ryc. 3).
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(c) Campomanesia xanthocarpa
mikroskopowa analiza morfologii pasożytów w mikroskopie świetlnym (powiększony ×1000) poprzez wykluczenie niebieskiego barwnika trypan. a) Kontrola; B) po 4 godzinach leczenia wodnym ekstraktem Verbena Sp.; c) po 4 godzinach leczenia wodnym ekstraktem Campomanesia xanthocarpa.
w celu zbadania możliwego wpływu C. xanthocarpa i Verbena sp., ekstrakty na błonie pasożytów, a także aby mieć wstępne dane dotyczące cytotoksyczności wobec komórek ssaków, przeprowadzono aktywność hemolityczną tych ekstraktów. Verbena Sp. z o. o. ekstrakty C. xanthocarpa zostały przebadane przy wartościach MIC i wykazały odpowiednio 6,5 i 7,6% lizy erytrocytów (Tabela 1). Wyniki te wykazały, że oba ekstrakty, przy wartościach MIC, nie promują znaczącej aktywności hemolitycznej, co wskazuje, że mechanizm działania odpowiedzialny za zmniejszenie żywotności pasożytów prawdopodobnie nie wiąże się z zakłóceniem błony pasożytniczej., Co więcej, co ważne, wyniki te sugerują, że oba ekstrakty nie są toksyczne dla komórek ssaków, ponieważ nie lizy ludzkich erytrocytów.
to badanie przyczynia się do ratowania rodzimej wiedzy o roślinach leczniczych. Autochtoniczne Mbyá – Guarani używają Verbena Sp. (Guachu ka ' a w języku Mbyá-Guarani), jako herbata, do łagodzenia objawów chorób zakaźnych, takich jak gorączka. Jest to zgodne z literaturą, która dotyczy Verbena Sp. wlew jako środek uspokajający, przeciwbólowy do chorób zapalnych, oparzeń skóry, braku miesiączki, depresji i chorób żołądka ., Ponadto gatunek ten ma wiele składników chemicznych, takich jak flawonoidy, glikozydy irydoidowe, glikozyd fenylopropanoidowy, sterole, triterpeny i glikokonjugat, a aktywność biologiczna może być im częściowo przypisana . Ponadto plemię to wykorzystuje liście C. xanthocarpa (Guavira w języku Mbyá-Guarani) do leczenia biegunki, bólu brzucha i robaków., Roślina ta jest tradycyjnie stosowana na południu Brazylii jako depuratująca, przeciwbiegunowa, oczyszczająca i przeciwreumatyczna oraz w celu obniżenia poziomu cholesterolu we krwi, a właściwości te można przypisać taninom , saponinom i flawonoidom (kwercetyna, myricetin, kwercytryna i rutyna), związkom obecnym w liściach C. xanthocarpa .
ratownicza etnofarmakologia historycznych zastosowań roślin jest uznawana za cenną dla bioprospekcji, ponieważ pozwala na racjonalną selekcję i badania roślin leczniczych ., W niniejszym badaniu opisano pierwsze sprawozdanie dotyczące działania antyprotozoalnego preparatu Verbena sp. i C. xanthocarpa. Ponadto inne gatunki z rodzin Verbenaceae i Myrtaceae były testowane przeciwko T. vaginalis, jednak bez powodzenia . Kilka bioróżnorodności i tradycyjna wiedza o różnych populacjach skłoniły badania do poszukiwania nowych prototypów anti-T. vaginalis. Ostatnio odnotowano potencjał roślin tradycyjnie stosowanych z Caatinga przeciwko T. vaginalis . Calzada et al., wykazano, że rośliny stosowane w zaburzeniach układu moczowo-płciowego w tradycyjnej medycynie meksykańskiej wykazały działanie przeciwko temu pierwotniakowi. Gatunki Amaryllidaceae stosowane przeciwko chorobom wenerycznym w RPA wykazały również obiecującą aktywność przeciwko T. vaginalis .
biorąc pod uwagę wpływ trichomonozy na zdrowie publiczne i rosnącą liczbę opornych izolatów T. vaginalis, konieczne jest alternatywy w leczeniu tej infekcji. Produkty naturalne są obiecującym źródłem aktywnych cząsteczek, a podejście etnofarmakologiczne ratuje wiedzę o populacji roślin leczniczych., Ta mądrość w połączeniu z badaniami chemicznymi i farmakologicznymi stanowi cenną wartość w bioprospekcji innowacyjnych, bezpiecznych i dostępnych leków. To pionierskie badanie wykazało istotne wyniki dotyczące aktywności anty-T. vaginalis VERBENA sp. i C. xanthocarpa, rośliny tradycyjnie wykorzystywane przez rdzenną ludność Mbyá-Guarani do chorób zakaźnych. Pomimo wykazania silnej aktywności przeciw T. vaginalis, raport ten uratował wiedzę rdzennej ludności, unikając poronienia tej mądrości.,
wkład autorów
Clara Lia Costa Brandelli i Patrícia de Brum Vieira w równym stopniu przyczyniły się do tego dzieła.
praca ta była wspierana przez program NANOBIOTEC-Brazil firmy CAPES i FAPERGS. Autorzy dziękują wodzowi José Cirilo Pires Morinico (plemię Mbyá-Guarani), za umożliwienie realizacji tego badania i za cenne informacje. Alexandre José Macedo i Tiana Tasca dziękują CNPq za stypendia naukowe.
Dodaj komentarz