Streszczenie
cel. Sarkoidoza jest ogólnoustrojową chorobą ziarniniakową o nieznanej etiologii. Zgłoszono wiele prezentacji klinicznych, a ostrą chorobę należy odróżnić od podostrej i przewlekłej choroby. Nieprzewidywalny przebieg kliniczny choroby skłonił nas do oceny klinicznej użyteczności wykrywania surowicy biomarkera w obserwacji sarkoidozy. Metody., Stężenia chitotriozydazy, ACE, KL-6 i lizozymu w surowicy analizowano różnymi metodami w populacji 74 pacjentów z sarkoidozą (46 leczonych steroidami podczas pobierania próbek), regularnie monitorowanych w Regionalnym Centrum skierowań sarcoidosis w Sienie oraz w grupie kontrolnej w celu porównania ich wkładu w kliniczne Zarządzanie pacjentami z sarkoidozą. Wyniki., Stężenia KL-6 były znacząco podwyższone u pacjentów z sarkoidozą ze zwłóknieniem płuc i były istotnie skorelowane z DLco i CPI score, podczas gdy chitotriozydaza była istotnie większa u pacjentów z lokalizacją pozapłucną. Przy wartości odcięcia 303,5 IU/ml KL-6 wykazywał najlepszą czułość (78%), podczas gdy chitotriozydaza wykazywała najlepszą swoistość (85%) wśród biomarkerów. Wnioski. KL-6 jest wiarygodnym biomarkerem zaangażowania włóknistego płuc u pacjentów z sarkoidozą., Wśród biomarkerów KL-6 wykazywał najlepszą czułość, a chitotriozydazę w surowicy najlepszą swoistość, nawet u pacjentów przewlekle leczonych steroidami i wydawał się korelować z lokalizacjami pozapłucnymi.
1. Wprowadzenie
sarkoidoza jest układową chorobą ziarniniakową związaną z aktywacją limfocytów T i makrofagów oraz migracją do dotkniętych narządów. Interakcja między antygenami i APC polaryzuje limfocyty T do fenotypu T helper 1 (Th1), co prowadzi do powstania sarkoidalnych ziarniniaków składających się z komórek T, makrofagów oraz komórek nabłonkowych i olbrzymich ., Przebieg sarkoidozy jest nieprzewidywalny: remisja występuje w większości przypadków, podczas gdy uporczywe zapalenie ziarniniaka może prowadzić do włóknistej choroby płuc . Specyficzne biomarkery o dobrej wrażliwości i swoistości są zatem potrzebne do przewidywania wyników klinicznych i kierowania decyzjami klinicznymi.
Chitotriozydaza ludzka jest biomarkerem wydzielanym przez aktywowane makrofagi i neutrofile. Chociaż jego fizjologiczna rola nie jest jasna, może odgrywać rolę w hydrolizie i degradacji chityny i substratów podobnych do chityny ., Obserwowano zwiększone stężenia chitotriozydazy w surowicy i BAL u pacjentów z aktywną sarkoidozą . Chitotriozydaza wykazuje korelację ze stopniami radiologicznymi. Może przewidywać przebieg kliniczny, reakcję sterydów i potencjalne nawroty choroby . Nie jest jednak jasne, czy chitotriozydaza jest wiarygodna w leczeniu pacjentów z sarkoidozą z zajęciem narządów pozapłucnych.
enzym konwertujący angiotensynę (Ace) jest kwaśną glikoproteiną, która przekształca angiotensynę i w angiotensynę II., Jest wytwarzany przez komórki śródbłonka płuca, głównie aktywowane makrofagi pęcherzykowe . Jest on podwyższony w surowicy i BAL u pacjentów z sarkoidozą, a jego stężenie koreluje z etapami radiologicznymi . Jednak jego użyteczność jako narzędzia diagnostycznego i prognostycznego jest ograniczona przez jego niską czułość i swoistość. ACE może być podwyższony w niektórych schorzeniach ziarniniakowych (w tym berylozie i silikozie), nadczynności tarczycy, cukrzycy i innych chorobach .
lizozym jest wytwarzany przez układ monocytów-makrofagów i komórki nabłonkowe zaangażowane w powstawanie ziarniniaków mogą uwolnić ten enzym., Pacjenci z sarkoidozą wykazują zwiększone stężenie lizozymu na początku. Lizozym jest uważany bardziej za wskaźnik prognostyczny niż narzędzie diagnostyczne. Ma niską specyficzność w chorobach płuc, takich jak gruźlica i pneumokonioza .
Krebs von den Lungen-6 (KL-6) jest ludzkim białkiem muc1 o wysokiej masie cząsteczkowej pochodzącym z AEC. Jego stężenia w surowicy są podwyższone w kilku ILDs, w tym idiopatycznym zwłóknieniu płuc i sarkoidozie ., W sarkoidozie KL-6 koreluje z aktywnością ACE: zwiększa się głównie u pacjentów w stadium 2 i 3 z scyntygraficznymi dowodami pozytywnej kumulacji płuc . Wysoki poziom surowicy KL-6 w sarkoidozie odzwierciedla produkcję KL-6 pochodzącą z uszkodzonych lub regenerujących pneumocytów typu 2 .
w tym badaniu porównaliśmy poziomy w surowicy różnych biomarkerów w kohorcie pacjentów z przewlekłą sarkoidozą, szukając korelacji z określonymi fenotypami, prezentacją kliniczną i lokalizacjami.
2. Materiały i metody
2.1., Populacja badana
retrospektywnie włączono 74 pacjentów z sarkoidozą (27 mężczyzn (36,5%), ze średnim wiekiem lat) regularnie monitorowanych w Regionalnym Centrum skierowania do sarkoidozy i ILDs w Sienie. Wszyscy pacjenci zostali zdiagnozowani zgodnie z międzynarodowymi kryteriami ATS/ERS / WASOG. Wszystkie były w obserwacji w naszym Centrum przez ponad 2 lata od diagnozy i wykazały przewlekłą chorobę. Kryteria wykluczenia obejmowały pacjentów z zespołem Lofgrena, ostrym wystąpieniem choroby, samoistnym ustąpieniem choroby lub obserwacją trwającą krócej niż 2 lata.,
w trakcie rekrutacji przeprowadzono pobieranie próbek surowicy: tego samego dnia wykonano badanie czynnościowe płuc (PFT) i RTG klatki piersiowej, w stadium radiologicznym według kryteriów Scadding. Klasyfikacja radiologiczna była związana z wykrywaniem próbek w standardowy sposób zgodnie z powszechnie przyjętymi kryteriami: etap 0, normalny; etap 1, dwustronna adenopatia hilarna bez udziału miąższu; etap 2, dwustronna adenopatia i naciek miąższowy; etap 3, naciek miąższowy; I Etap 4, zwłóknienie płuc związane z sarkoidozą., Wszyscy pacjenci przeszli tomografię komputerową klatki piersiowej o wysokiej rozdzielczości (HRCT) w celu sprawdzenia zwłóknienia płuc. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę na badanie, zatwierdzoną przez lokalną Komisję Etyczną. W celu ustalenia wartości odcięcia surowicy KL-6 w naszej populacji pobraliśmy próbki surowicy od 25 zdrowych ochotników (6 mężczyzn, średni wiek), bez chorób układu oddechowego i bez przyjmowania jakichkolwiek leków
2.2., Badania czynnościowe płuc
przeprowadzono następujące pomiary czynnościowe płuc zgodnie ze standardowymi parametrami ATS/ERS przy użyciu Pletyzmografu ciała Jaegera z poprawkami temperatury i ciśnienia barometrycznego: wymuszona objętość wydechowa w pierwszej sekundzie (FEV1), wymuszona pojemność życiowa (FVC) i rozproszony tlenek węgla w płucach (DLCO). Wszystkie parametry zostały wyrażone w procentach wartości przewidywanych .
2.3., Fenotypowanie kliniczne
pacjentów klasyfikowano na podstawie radiologicznego zaangażowania płuc i lokalizacji sarkoidozy, zgodnie z najnowszą relacją genotyp-fenotyp w dokumencie sarkoidozy (Genfenresa) , a także na podstawie composite physiologic index (CPI). U każdego pacjenta obliczyliśmy CPI według następującego wzoru, jak wcześniej opisano: 91 − ( predicted DLCO) − ( predicted FVC) + .,
lokalizacje pozapłucne choroby oceniano za pomocą swoistych narządowych dróg diagnostycznych: obecność wątroby, śledziony, kości, szpiku kostnego, węzłów chłonnych pozaustrojowych i skóry potwierdzono biopsją, natomiast lokalizację serca oceniano za pomocą obrazowania MR.
2.4. Test chitotriozydazy
aktywność Chitotriozydazy oznaczono metodą fluorymetryczną z zastosowaniem β-D-N,N,N-triacetylochitotriozydazy 22 µM (Sigma Chemical Co .) w buforze cytrynianowo-fosforanowym, pH 5,2; 100 µl substratu inkubowano przez 1 h w temperaturze 37°C, a reakcję zatrzymano 1,4 ml 0.,1 M bufor glicyna-NaOH, pH 10,8. Fluorescencję odczytywano przy 450 nm za pomocą fluorometru PerkinElmer Victor X4 (długość fali wzbudzenia 365 nm). Aktywność chitotriozydazy w surowicy została wyrażona w nmol / ml / h. wartości normalności zostały obliczone zgodnie z naszymi poprzednimi badaniami .
2.5. Test ACE
aktywność ACE oznaczano metodą kolorymetryczną (FAR srl, Werona, Włochy)w celu określenia aktywności ACE w surowicy. Normalny zakres stężeń ACE wynosił 30-80 J. M. / l.
2.6. Test lizozymu
2.7., Test Krebsa von den Lungen-6
w surowicy KL-6 oznaczano metodą NANOPIA® KL-6 reagents assay (Sekisui Diagnostics, UK). Zasadą testu jest aglutynacja sialiylowanego antygenu węglowodanowego w próbkach z przeciwciałem monoklonalnym KL-6 w drodze reakcji antygen-przeciwciało. Zmiana absorbancji jest mierzona w celu określenia poziomu KL-6 w surowicy. Stężenia KL-6 wyrażone są w J. M. / ml.
2.8. Analiza statystyczna
dane zostały wyrażone jako . Porównań pomiędzy grupami dokonano za pomocą testu Manna-Whitneya i testu Kruskala-Wallisa o znaczeniu ustalonym na., Test Spearmana był używany do poszukiwania korelacji między zmiennymi. Analiza statystyczna i krzywe ROC zostały wykonane przy użyciu oprogramowania Statistica v 7.0; graficzne reprezentacje danych zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 4.0.
3. Wyniki
3.1. Parametry kliniczne, radiologiczne i czynnościowe
cechy demograficzne, wartości testu czynnościowego płuc i zmniejszające się stadium radiologiczne populacji przedstawiono w tabeli 1. Zgodnie z oczekiwaniami , pierwsze objawy występowały głównie w piątej dekadzie (latach), rozpowszechnione u nigdy nie palących samic., W wywiadzie medycznym 46 pacjentów (62%, 17 mężczyzn) było leczonych steroidami w czasie pobierania próbek surowicy, ze średnią dawką prednizonu. Z nich, wszystkie z wyjątkiem jednego brały doustne sterydy przez ponad rok. 13 pacjentów (3 mężczyzn) przyjmowało leki immunosupresyjne w skojarzeniu z doustnymi steroidami (12 z metotreksatem, 1 z azatiopryną). Wśród podgrupy wolnej od steroidów (28 pacjentów, 10 mężczyzn) tylko dwóch pacjentów nigdy nie podjęło specyficznej terapii sarkoidozy.,
w naszej populacji parametry PFT mieściły się w normalnym zakresie bez znaczącej zmiany objętości płuc: 63 pacjentom udało się wykonać akceptowalny manewr DLCO, który był średnio łagodnie osłabiony.
3.2. Porównanie biomarkerów
stężenie KL-6 w surowicy zostało obliczone u wszystkich pacjentów i zdrowych ochotników; ACE i lizozym wykryto w surowicy wszystkich pacjentów. U sześciu pacjentów z aktywnością chitotriozydazy <10 nmol/ml/h podejrzewano polimorfizm CHIT1 i wykluczono ich z analizy.,
nie stwierdzono istotnych różnic poziomów biomarkerów pomiędzy pacjentami leczonymi steroidami a pacjentami leczonymi steroidami i terapią immunosupresyjną.
KL-6 był istotnie skorelowany z aktywnością ACE (; ), lizozymu (;) i chitotriozydazy (; ) (rycina 1).,
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.3. Organ Involvement and Phenotypes
The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., Najczęstszymi lokalizacjami pozapłucnymi była skóra (16 pacjentów, 21,6%), śledziona (11 pacjentów, 14,8%) i wątroba (5 pacjentów, 6,7%). Rzadziej występowały lokalizacje oczu (3 pacjentów, 4% przypadków) i węzłów chłonnych pozatorakowych (3 pacjentów, 4%); OUN (2 pacjentów, 2,7% przypadków) oraz zajęcie serca, kości lub szpiku kostnego (1,3% przypadków). U pacjentów z sarkoidozą z zajęciem pozapłucnym aktywność chitotriozydazy była znacznie większa niż u pacjentów z ograniczoną chorobą płuc (;) (rycina 3). Nie zaobserwowano innych istotnych różnic w odniesieniu do lokalizacji narządów.,
w odniesieniu do fenotypów Genfenresy u pacjentów z zajęciem jamy brzusznej () stwierdzono istotnie większą aktywność chitotriozydazy niż u pacjentów z zajęciem oka-serca-skóry-ośrodkowego układu nerwowego (OCCC) (), układu mięśniowo-szkieletowego-skóry () i izolowanym zajęciem płuc () (,,)., Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy poziomami KL-6, ACE i lizozymu w tych podgrupach.
zgodnie z oceną radiologiczną, u pacjentów z fibrotic sarkoidosis (Etap 4) stwierdzono najwyższe stężenie KL-6 w surowicy krwi w porównaniu do innych radiologicznych stadiów choroby () (ryc. 4).
4., Dyskusja
wiele biomarkerów zaproponowano dla sarkoidozy, ale żaden nie wykazał zadowalającej wartości prognostycznej dla identyfikacji nawrotu w trakcie terapii lub lokalizacji ważnych narządów. W tym badaniu porównaliśmy różne biomarkery sarkoidozy. Wybraliśmy pacjentów z chorobami przewlekłymi w leczeniu przez ponad 1 rok z danymi klinicznymi i demograficznymi zgodnymi z ogólnymi cechami sarkoidozy opisanymi w literaturze . Włączyliśmy KL-6 na listę biomarkerów, chociaż białko to zostało zbadane w IPF i dostępnych jest niewiele danych na temat jego roli w sarkoidozie., Nasze zainteresowanie KL-6 było związane z jego raportowaną korelacją z ciężkim zajęciem włókniaka płuc i słabym przeżyciem . Chitotriozydaza, ACE i lizozym wykazywały mniejszą częstość występowania w naszej populacji niż wcześniej obserwowano, prawdopodobnie dlatego, że większość pacjentów była długotrwale leczona układowo steroidami i nie wykazywała oznak aktywnej choroby w momencie pobierania próbek surowicy. Wręcz przeciwnie, KL-6 wykazywał dobrą czułość i swoistość w naszej populacji, przy wartości odcięcia 303,5 IU / ml., Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie, w którym zbadano specyficzną wartość odcięcia KL-6 w przewlekłej sarkoidozie w porównaniu z grupą zdrowych kontrolnych; jednak nie było to głównym celem badania, a dane muszą zostać zweryfikowane w szerszej kohorcie pacjentów. Nasze wyniki potwierdziły wartość prognostyczną KL-6 dla włóknistego zaangażowania płuc i upośledzenia czynnościowego u pacjentów z sarkoidozą ILD już zgłoszonych przez Miyoshi et al., ; jednak nasze badanie jest pierwszym, które pokazuje znaczącą korelację między biomarkerem surowicy, KL-6, A zaangażowaniem włókniaka płuc u pacjentów z sarkoidozą, ilościowo oznaczonym wskaźnikiem CPI. Co więcej, odkrycie to jest dodatkowo potwierdzone znaczącą korelacją z procentami DLCO, podtrzymując potencjalną użyteczność pomiarów KL-6 do oceny stopnia nasilenia sarkoidozy w klinicznym leczeniu tych pacjentów., Dane te były spójne bez względu na status leczenia, co sugeruje, że przewlekła aktywacja makrofagów nie reaguje na leczenie steroidami, w szczególności u pacjentów z włókniakową chorobą płuc. Nie stwierdzono istotnych różnic ekspresji KL-6 wśród fenotypów klinicznych i (lub) lokalizacji pozapłucnej, co wskazuje, że KL-6 może być uznany za wiarygodny tylko w przypadku zajęcia płuc choroby. Wykryto pozytywne korelacje wśród biomarkerów sarkoidozy, w tym ACE, lizozymu, chitotriozydazy i KL-6, które można zatem włączyć do listy wskaźników prognostycznych.,
z drugiej strony, chitotriozydaza okazała się bardziej wrażliwa niż Ace, lizozym i KL-6 nawet u pacjentów leczonych systemowo; wydaje się również być jedynym biomarkerem, który może odzwierciedlać zaangażowanie pozatorakowe, zgodnie z najnowszą klasyfikacją fenotypu klinicznego Genfenresa., W szczególności jego ekspresja jest bardziej wyraźna u pacjentów z lokalizacją narządów jamy brzusznej (wątroba i śledziona, w naszej populacji), prawdopodobnie z powodu nadekspresji przez aktywowane makrofagi zamieszkujące; dane te sugerują, że chitotriozydaza może być wiarygodnym markerem aktywacji układu retikuloendotelialnego w sarkoidozie, jak wcześniej donoszono u pacjentów z chorobą przechowywania lizosomalnej . Nie ma dostępnych badań dotyczących wartości prognostycznej chitotriozydazy w lokalizacjach śledziony i sarkoidozy wątrobowej, co jest istotną nowością w tym badaniu., W przeciwieństwie do KL-6, aktywność chitotriozydazy wydaje się nie być skorelowana z ciężkością sarkoidalnego zaangażowania płuc lub upośledzenia czynnościowego, co sugeruje, że różne wzory aktywacji makrofagów mogą być obecne w układzie oddechowym pacjentów z sarkoidozą i wpływać na ekspresję biomarkerów .
podsumowując, pacjenci z przewlekłą sarkoidozą, ciężkim zajęciem pozapłucnym lub niewydolnością włóknienia stopnia 4 stanowią ważny cel wymagający identyfikacji wiarygodnych biomarkerów prognostycznych w celu przewidzenia nawrotu choroby i odpowiedzi na leczenie ogólnoustrojowe.,
na podstawie tych wstępnych wyników obserwowano wysokie poziomy chitotriozydazy i KL-6 (a nie ACE lub lsysozyme) u pacjentów z przewlekłą sarkoidozą, niezależnie od leczenia. Aktywność chitotriozydazy była znacząco wyższa u pacjentów z zajęciem wielu narządów, wykazując obiecującą wiarygodność oceny wielostrefowej sarkoidozy. Wręcz przeciwnie, poziomy KL-6 skorelowane z zajęciem włókniaka płuc, wynikiem CPI i zmniejszonym procentem DLCO sugerują potencjalną rolę jako markera ciężkości sarkoidozy płucnej., Co ciekawe, wyniki te odnotowano w populacji pacjentów z przewlekłą wieloorganową sarkoidozą, w tym pacjentów leczonych, zwiększając wiarygodność chitotriozydazy i KL-6 również w tym otoczeniu.
dostępność danych
zbiory danych wygenerowane podczas i / lub analizowane podczas bieżącego badania są dostępne od autora korespondenta na uzasadnione żądanie. Dane są dostępne od Laura Bergantini ([email protected]) i Elena Bargagli ([email protected]) dla naukowców spełniających kryteria dostępu do poufnych danych.,
konflikty interesów
autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.
wkład autorów
Laura Bergantini i Francesco Bianchi również przyczynili się do opracowania.
Dodaj komentarz