Learning objects

  • Recall dideoxynucleotide sequencing

Sanger sequencing, znany również jako sekwencjonowanie po zakończeniu łańcucha, odnosi się do metody sekwencjonowania DNA opracowanej przez Fredericka Sanger w 1977 roku. Metoda ta opiera się na amplifikacji fragmentu DNA, który ma być sekwencjonowany przez polimerazę DNA i inkorporacji zmodyfikowanych nukleotydów-konkretnie dideoksynukleotydów (ddNTPs).,

klasyczna metoda zakończenia łańcucha wymaga jednoniciowego szablonu DNA, podkładu DNA, polimerazy DNA, normalnych deoksynukleotydotrifosforanów (dNTPs) i zmodyfikowanych nukleotydów (dideoxyNTPs), które kończą wydłużenie nici DNA. Te nukleotydy kończące łańcuch nie posiadają grupy 3 ' – OH wymaganej do tworzenia wiązania fosfodiestrowego między dwoma nukleotydami, powodując, że polimeraza DNA przestaje rozszerzać DNA, gdy włącza się ddNTP. DdNTPs mogą być znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie w celu wykrycia w automatycznych maszynach do sekwencjonowania.,Próbka DNA jest podzielona na cztery oddzielne reakcje sekwencjonowania, zawierające wszystkie cztery standardowe deoksynukleotydy (dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i polimerazę DNA. Do każdej reakcji dodaje się tylko jeden z czterech dideoksynukleotydów (ddATP, ddGTP, ddctp lub ddTTP). Po zakończeniu prób rozciągania wzorcowego DNA z związanego podkładu, powstałe fragmenty DNA są denaturowane cieplnie i oddzielone wielkością za pomocą elektroforezy żelowej. Jest to często wykonywane przy użyciu denaturującego żelu poliakrylamidowo-mocznikowego, przy czym każda z czterech reakcji przebiega w jednym z czterech pojedynczych pasów (pasy A, T, G, C)., Pasma DNA mogą być wizualizowane przez autoradiografię lub światło UV i sekwencja DNA może być bezpośrednio odczytywane z filmu rentgenowskiego lub obrazu żelu.

rysunek: sekwencjonowanie Sangera: różne rodzaje sekwencjonowania Sangera, z których wszystkie zależą od sekwencji zatrzymywanej przez kończący się dideoksynukleotyd (czarne paski).,

techniczne odmiany sekwencjonowania zakończenia łańcucha obejmują znakowanie nukleotydami zawierającymi radioaktywny fosfor do znakowania radioizotopowego lub za pomocą podkładu oznaczonego na końcu 5′ fluorescencyjnym barwnikiem. Sekwencjonowanie Dye-primer ułatwia odczyt w systemie optycznym w celu szybszej i bardziej ekonomicznej analizy i automatyzacji. Późniejsze opracowanie przez Leroy Hooda i współpracowników fluorescencyjnie oznakowanych ddNTPs i primerów stworzyło scenę dla zautomatyzowanego, wysokowydajnego sekwencjonowania DNA. Metody zakończenia łańcucha znacznie uprościły sekwencjonowanie DNA., Ostatnio opracowano sekwencjonowanie dye-terminator. Dye-terminator sequencing wykorzystuje etykietowanie łańcucha terminator ddNTPs, który pozwala na sekwencjonowanie w jednej reakcji, a nie cztery reakcje jak w metodzie marked-primer. W sekwencjonowaniu Terminatorów barwnikowych każdy z czterech Terminatorów łańcucha dideoksynukleotydów jest oznaczany fluorescencyjnymi barwnikami, z których każdy emituje światło o różnych długościach fal.,

rysunek: Chromatograf: jest to przykład wyjścia sekwencjonowania Sangera odczytywanego przy użyciu fluorescencyjnie oznakowanych Terminatorów barwnikowych. Cztery zasady DNA są reprezentowane przez różne kolory, które są interpretowane przez oprogramowanie w celu nadania powyższej sekwencji DNA.

zautomatyzowane przyrządy do sekwencjonowania DNA (sekwencery DNA) mogą sekwencjonować do 384 próbek DNA w jednej partii (uruchomić) w maksymalnie 24 Działa dziennie., Sekwencery DNA przeprowadzają elektroforezę kapilarną w celu separacji wielkości, wykrywania i rejestrowania fluorescencji barwnika oraz danych wyjściowych jako fluorescencyjne szczytowe chromatogramy śladowe. Automatyzacja doprowadziła do sekwencjonowania całych genomów.

kluczowe punkty

  • brak drugiej grupy deoksy na dNTP, co czyni go ddNTP, zatrzymuje inkorporację kolejnych nukleotydów, to zakończenie tworzy długości DNA zatrzymane na każdym nukleotydzie, jest to kluczowe dla dalszej identyfikacji każdego nukleotydu.,
  • można stosować różne etykiety, ddntps, dNTPs i podkłady, wszystkie mogą być znakowane radioaktywnością i fluorescencyjnie.
  • za pomocą fluorescencyjnych etykiet, dideoxy sekwencjonowanie może być zautomatyzowane, umożliwiając metody o dużej przepustowości, które zostały wykorzystane do sekwencji całych genomów.

kluczowe terminy

  • chromatogram: wizualny wynik z chromatografu. Zazwyczaj wyświetlacz graficzny lub histogram.
  • dideoksynukleotyd: dowolny nukleotyd utworzony z deoksynukleotydu przez utratę drugiej grupy hydroksylowej z grupy deoksyrybozy