PMC (Nederlands)

tekst

Natalizumab, een antilichaam dat wordt gebruikt voor de behandeling van relapsing multiple sclerose (MS), voorkomt de handel in geactiveerde lymfocyten, waaronder autoreactieve lymfocyten, door de bloed-hersenbarrière (BBB). Het belangrijkste nadelige effect van natalizumab is progressieve multifocale leuko-encefalopathie (PML), een verwoestende demyeliniserende ziekte veroorzaakt door replicatie van humaan JC polyomavirus (JCV) in oligodendrocyten en astrocyten (1, 2)., De remming door Natalizumab van de T-cel van de effector van het bloed naar het centrale zenuwstelsel (CZS) kan lokale JCV-replicatie (3-7) ten goede komen.

hier onderzochten we de aanwezigheid van JCV-specifieke effectorgeheugen T-cellen (tem) in bloed van MS-patiënten na nachtelijke antigeenactivering ex vivo. In vivo, dalen de specifieke tem aantallen zodra het verwante antigeen (8-10) wordt geklaard, en hun aanwezigheid kan zo op lopende JCV replicatie wijzen. Tem geeft snel cytokines af zoals gamma interferon (IFN-γ) wanneer ze opnieuw worden blootgesteld aan antigeen., Een eerdere enzyme-linked immunosorbent spot assay (ELISPOT) onderzocht IFN-γ-expressie in T-cellen na langdurige activering met JCV-peptiden gedurende maximaal 14 dagen (11). Nochtans, staat de verlengde activering het rustige t-celgeheugen op lange termijn toe om te worden gereactiveerd en uit te breiden, betekenend dat een positieve reactie niet noodzakelijk een voortdurende immune reactie betekent. Hier onderzochten we eerst de aanwezigheid van JCV-specifieke TEM bij twee MS-patiënten die PML ontwikkelden. De eerste patiënt werd gediagnosticeerd met PML na 39 maanden natalizumab (39 infusies) (afdeling Neurologie, ziekenhuis Pitié-Salpétrière)., Ze was 39 jaar oud en had een 10-jarige geschiedenis van relapsing-remitting MS.voorafgaand aan natalizumab had ze cyclofosfamide en mitoxantron gekregen. PML werd bevestigd door MRI en JCV PCR op cerebrospinaal vocht (CSF). Toen ze 8 weken na aanvang van het PML-symptoom werd getest op JCV-specifieke tem, had ze 1040 JCV-genoomkopieën per ml CSF (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Haar perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) werden in vitro geactiveerd in AIM-V en Albumax medium (Invitrogen) gedurende 16 uur met gezuiverd JCV (stam MAD-4; LGC Promochem; 104,5 50% weefselkweek infectieuze dosis /0,2 ml)., Er werd geen recombinant interleukine 2 (IL-2) toegevoegd. Aan elk putje werd een hoeveelheid virus toegevoegd die overeenkomt met 5,534 PFU. Dit kwam overeen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,02. De cellen werden toen getest voor intracellular IFN-γ Door cytometry stroom. De celsterfte na nachtelijke activering was minder dan 5%. Zoals in Fig. 1A en andB,B, reagerende cellen werden gedetecteerd in zowel de CD4 als CD8 T-cel subsets, en de meeste van hen hadden het ccr7− CD45RA− fenotype karakteristiek voor geheugeneffecten (12)., Anti-JCV TEM werden ook gedetecteerd door IFN-γ ELISPOT (capture en detection antilichamen, klonen 1-D1 en K7-B6-1, respectievelijk; Mabtech) na 16 uur activering met gezuiverde JCV of VP-1 peptiden (een mix van 14 pools van overlappende 15-aminozuur peptiden die het gehele JCV VP-1 eiwit bedekken) (Fig. 1C). De tweede patiënt was 46 jaar oud en had een geschiedenis van 11 jaar van relapsing-remitting MS.voorafgaand aan natalizumab had ze bèta-interferon, glatirameracetaat, azathioprine en mitoxantron ontvangen. Ze werd doorverwezen naar het Tenon Hospital MS center voor herevaluatie na 24 natalizumab infusies., Een MRI van de hersenen uitgevoerd in Mei 2012 ontdekte een kleine, lineaire, T2-hyperintense verdachte laesie in de juxtacorticale rechter frontale regio. De eerste CSF-steekproef was negatief voor JCV. Herhaalde MRI na het staken van natalizumab toonde een toename van de laesiegrootte aan, wat leidde tot twee verdere CSF-onderzoeken, die beide negatief waren voor JCV. JCV PCR op plasma werd 2 en 4 maanden na het begin van PML uitgevoerd. Beide plasmamonsters waren negatief. Hersenbiopsie uitgevoerd in September 2012 bevestigde uiteindelijk de diagnose van PML.,

elispot-analyse van de IFN-γ-respons op JCV, uitgevoerd 2 dagen na de laatste natalizumab-infusie, toonde de aanwezigheid van JCV-specifieke TEM in het bloed (Fig. 1C). Interessant is dat circulerende JCV-specifieke tem-aantallen lager waren dan bij de eerste PML-patiënt, die mogelijk een hoger niveau van JCV-replicatie in de hersenen had, aangezien JCV PCR op CSF positief was bij de eerste patiënt en negatief bij de tweede.,

we onderzochten ook de aanwezigheid van JCV-specifieke tem door ELISPOT bij een reeks van 62 MS-patiënten met relapsing-remitting MS die behandeld werden met natalizumab volgens de Europese marketingtermen, evenals bij 35 MS-patiënten die geen disease-modifying therapie kregen, en een groep van 40 gezonde donoren die qua leeftijd en geslacht overeenkwamen met MS-patiënten. Kenmerken van de MS-patiënten worden weergegeven in Tabel 1. De patiënten en gezonde donoren gaven hun schriftelijke toestemming om deel te nemen aan de studie, die werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Pitié-Salpêtrière ziekenhuis, Parijs., Een ELISPOTRESPONS werd als positief beschouwd als het gecorrigeerde aantal vlekken (aantal vlekken in geactiveerde putjes minus aantal vlekken in onbehandelde putjes) ten minste 10 was, met minder dan 10 vlekken in onbehandelde putjes.

het percentage positieve monsters was 2,5% bij gezonde donoren (Fig. 2 bis). In de MS-groep steeg het percentage positieve patiënten met de tijd die natalizumab kreeg (Fig. 2B en andC), C), van 8,8% bij onbehandelde MS-patiënten tot 15,9% bij patiënten die minder dan 24 maanden met natalizumab werden behandeld en 27% bij patiënten die langer dan 24 maanden werden behandeld (Fig., 2C) (significant voor patiënten die langer dan 24 maanden werden behandeld versus onbehandelde MS en versus controlepersonen). Deze toename van de detectiefrequentie van JCV tem-responsen suggereerde dat langdurige behandeling met natalizumab de reactivering van JCV bevorderde.

een subgroep van met natalizumab behandelde patiënten werd minstens tweemaal bemonsterd (zie Tabel 1). Zoals in Fig. 2D, de meeste van deze patiënten werden of bleven positief tijdens de bemonsteringsperiode.,

de nier is een belangrijk reservoir voor JCV. Een significant percentage van de algemene bevolking excreteert het virus in hun urine, maar heeft geen bewijs van JCV in hun bloed (13-15). Bovendien blijkt de aanwezigheid van JCV-DNA in de hersenen onafhankelijk te zijn van de aanwezigheid ervan in de nieren (16). Zoals in Fig. 2E, 60% van de MS-patiënten met detecteerbare JCV tem in het bloed had geen detecteerbare JCV in de urine, en 69% van de patiënten met positieve JCV PCR in de urine had geen detecteerbare JCV tem. JCV urinaire excretie zonder aantoonbare JCV TEM werd ook waargenomen bij gezonde donoren (Fig. 2E)., Dit suggereert dat de aanwezigheid van JCV replicatie in de nieren niet noodzakelijk leidt tot detecteerbare JCV TEM in bloed. Omgekeerd, dit verhoogt de mogelijkheid dat JCV tem opsporing in bloed lopende extrarenale JCV replicatie kan weerspiegelen.

in een studie waarbij een nieuwe JCV enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methode (17) werd gebruikt, was de geschatte seroprevalentie van JCV bij MS-patiënten die met natalizumab werden behandeld 53,6% (17). Seropositiviteit correleert niet noodzakelijk met de aanwezigheid van tem-responsen, die verband houden met virusreactivering., Langlevende plasmacellen kunnen in het beenmerg gedurende lange tijd, misschien tientallen jaren, aanhouden, waarbij aanhoudende serumantistiters worden gehandhaafd zonder actieve pathogeenreplicatie (18, 19). We gebruikten dezelfde ELISA-methode om 56 met natalizumab behandelde MS-patiënten te testen die door JCV ELISPOT waren getest, inclusief de 2 PML-patiënten. Zoals in Fig. 2f was 53,6% van de patiënten seropositief en 16,1% ELISPOT-positief. Zevenentwintig procent van de JCV-seropositieve patiënten had aantoonbare JCV TEM in hun bloed. Slechts één patiënt die positief was voor JCV ELISPOT was seronegatief., Volgens Gorelik et al., is het vals-negatieve percentage van de JCV-serologische assay 2,5% (17).

onze resultaten tonen aan dat de frequentie van detectie van JCV tem responsen bij MS-patiënten toeneemt met de tijd die natalizumab gebruikt. Een eerdere studie toonde ook een toename in T-cel responsen op JCV na 12 maanden natalizumab therapie, maar deze studie was beperkt tot 18 maanden behandeling (20), terwijl we vonden dat de sterkste toename in effector T-cel responsen optrad na 24 maanden.,

onze resultaten wijzen dus op JCV-reactivering tijdens behandeling met natalizumab, inclusief op extraterenale plaatsen. JCV is gedetecteerd in de hersenen van HIV-seronegatieve individuen zonder PML (21). De verminderde CNS immunosurveillance geïnduceerd door natalizumab zou lokale virusreactivering kunnen bevorderen die kan beginnen als asymptomatische intermitterende virusreplicatie, maar zou kunnen evolueren naar aanhoudende virusreplicatie en vervolgens naar PML. Virusreactivering kan perifere specifieke T-lymfocyten activeren, via antigeen-presenterende cellen, op locaties zoals hersendrainende cervicale lymfeklieren (22-24)., Aangezien natalizumab zich richt op de VLA-4-receptor, kunnen deze specifieke cellen niet efficiënt de bloed-hersenbarrière passeren en kunnen ze zich dus ophopen in het bloed, waardoor ze gemakkelijker kunnen worden gedetecteerd. PML is ook een complicatie van HIV-infectie in een laat stadium. Of de detectie van JCV-specifieke effector CD4 en CD8 T cellen kan voorafgaan aan AIDS-geassocieerde PML is een punt van belang dat verder onderzoek verdient. AIDS-geassocieerde PML verschilt echter duidelijk van natalizumab-geïnduceerde PML., De meeste HIV-geïnfecteerde patiënten die PML ontwikkelen hebben diepe CD4-lymfopenie, die ook CD8 T-celfunctionaliteit verandert door het gebrek aan CD4-hulp (25). Bovendien is er, in tegenstelling tot patiënten die natalizumab gebruiken, geen blokkade van de handel in T-cellen door de bloed-hersenbarrière, en dit kan JCV-specifieke tem-accumulatie in bloed voorkomen.

samen suggereren onze resultaten dat functionele tests die JCV-specifieke tem-responsen kunnen detecteren, kunnen helpen bij het identificeren van patiënten met een risico op het ontwikkelen van PML tijdens de behandeling met antilichamen die de lymfocytenhandel door de bloed-hersenbarrière remmen.,