Abstract
Trichomonas vaginalis, een flagellaatprotozoaan, is de veroorzaker van trichomonose, de meest voorkomende niet-virale seksueel overdraagbare aandoening wereldwijd. Rekening houdend met de verhoogde prevalentie van metronidazol-resistente isolaten, zijn alternatieve geneesmiddelen essentieel voor de succesvolle behandeling. Natuurlijke producten zijn de bron van de meeste nieuwe medicijnen en populaire wijsheid over het gebruik van medicinale planten is een krachtig hulpmiddel in deze zoektocht., In deze studie werd de activiteit van 10 medicinale planten die veelvuldig in het dagelijks leven worden gebruikt door de inheemse mbyá-Guarani groep geëvalueerd tegen zeven verschillende T. vaginalis isolaten. Onder de geteste waterige extracten, Verbena sp. (Guachu ka ‘ A in Mbyá-Guarani taal) en Campomanesia xanthocarpa (Guavira in mbyá-Guarani taal) vertoonden de hoogste activiteit tegen T. vaginalis met een MIC-waarde van 4,0 mg/mL die 100% van de werkzaamheid tegen de parasiet bereikte. De kinetische groeianalyses toonden aan dat de extracten volledige groeiafbraak bevorderden na 4 uur incubatie., Bovendien bevorderden de geteste extracten geen significante hemolytische activiteit tegen menselijke erytrocyten. Onze resultaten tonen voor het eerst de potentiële activiteit van Verbena sp. en C. xanthocarpa tegen T. vaginalis. Bovendien toont deze studie aan dat inheemse kennis een belangrijke bron is van nieuwe prototypes van antiprotozoale middelen.
1. Inleiding
Trichomonas vaginalis parasiteert het urogenitale menselijke darmkanaal en veroorzaakt trichomonose, de meest voorkomende niet-virale seksueel overdraagbare aandoening wereldwijd, die verantwoordelijk is voor 248 miljoen nieuwe gevallen per jaar ., Na kolonisatie veroorzaakt de parasiet vaginitis, urethritis en prostatitis . Bovendien is de ziekteverwekker geassocieerd met ernstige gevolgen als ongunstige zwangerschapsuitkomsten en vroeggeboorte , onvruchtbaarheid , predispositie voor baarmoederhalskanker en ontstekingsziekte in het bekken . Belangrijk is dat trichomonose fungeert als een cofactor in de overdracht en verwerving van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV). Ondanks de impact van deze infectie, is het therapeutische arsenaal beperkend en alleen metronidazol en tinidazol, beide 5-nitroimidazole-geneesmiddelen, zijn goedgekeurd door de FDA voor trichomonosebehandeling ., Hoewel het genezingspercentage hoog is, kan het falen van de behandeling worden waargenomen en de resistentie van T. vaginalis isolaten is de belangrijkste reden van het falen van de behandeling . In die zin is het ongetwijfeld noodzakelijk dat het onderzoek naar nieuwe alternatieven voor de behandeling van trichomonose en twee strategieën kan worden gevolgd: (i) het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen, wat essentieel is voor de rationele ontwikkeling van nieuwe antiparasitaire middelen en (ii) het onderzoek naar nieuwe anti-T., vaginalis verbindingen structureel verschillend van 5-nitroimidazolen en, bijgevolg, handelend door ander mechanisme zoals aangetoond door onze groep .
in deze context zijn natuurlijke producten, met name geneeskrachtige planten, onmeetbaar als een krachtige bron van bioactieve moleculen. Sinds de oudheid gebruiken mensen planten om gemeenschappelijke infectieziekten te behandelen, en sommige van deze traditionele geneesmiddelen zijn nog steeds geïntegreerd als onderdeel van de genezing van diverse pathologieën . Daarnaast redt de zoektocht op basis van etnofarmacologische informatie de immense empirische kennis van plantengebruik ., Wat het natuurlijke milieu en de enorme rijkdom aan genetische hulpbronnen betreft, is Brazilië een land van groot belang voor de etnofarmacologie .
inheemse mensen beschikken over een schat aan informatie over biodiversiteit en weten hoe ze natuurlijke hulpbronnen moeten vangen en gebruiken . Ondanks het feit dat verschillende drugs zijn ontdekt door middel van traditionele kuren en volkskennis, zijn er in Brazilië 122 inheemse etnische groepen, maar slechts 30% van hen werd onderzocht met betrekking tot etnobotanische aspecten ., Daarom is de studie van planten gebruikt door de inheemse geneeskunde is belangrijk om de traditionele geneeskunde en biotische omgeving met elkaar te verbinden behoud van de inheemse oude kennis.
parasitaire protozoa blijven een belangrijke bedreiging voor de gezondheid van mens en dier en er zijn weinig effectieve geneesmiddelen voor de behandeling van veel protozoale ziekten. Rekening houdend met de inheemse etnofarmacologie als bijdrage aan de systematische screening van planten met antiprotozoale activiteit, evalueerde deze studie de anti-T., vaginalis activiteit van de belangrijkste medicinale planten gebruikt in Mbyá-Guarani inheemse geneeskunde gelegen in het zuiden van Brazilië.
2. Materialen en methoden
2.1. Parasietkweekcondities
in dit onderzoek werden zeven isolaten van T., vaginalis werden gebruikt: 30236 en 30238 van de American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2, en TV-LACM3 (vers klinische isolaten van vrouwelijke patiënten); TV-LACH1 en TV-LACH2 (vers klinische isolaten van mannelijke patiënten) alle van Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brazilië (project met ethische goedkeuring door UFRGS Ethische Research Committee, het aantal 18923). Trichomonaden werden axenisch gekweekt in trypticase-gistextract-maltose (TYM) medium (pH 6,0), aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd runderserum en geïncubeerd bij 37°C .
2.2., Plantaardig materiaal
plantaardig materiaal werd verzameld bij de inheemse stam Mbyá-Guarani, gelegen op de Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brazilië (30 ° 06 ‘47,62″ Z en 51 ° 07 ‘37,85″ W), in maart 2011. Dit dorp wordt aangeduid Tekoá Anhetenguá( in het Engels, echte dorp), en 200 mensen wonen in het gebied verzameld op 40 gezinnen. De vrouwen van het dorp hebben de kennis van geneeskrachtige planten die door de gehele bevolking worden gebruikt en voerden de verzameling van specimens uit. Tien planten die routinematig worden gebruikt in de inheemse geneeskunde voor infectieziekten werden verzameld: bladeren van aloë arborescens Mill., (ICN 173371), bovengrondse delen van Bidens pilosa L. (ICN 167397), bovengrondse delen van Rhipsalis baccifera (ICN 167402), blaft van Luehea divaricata (ICN 167403), wortels van Trichilia sp. (LIW 173126), bladeren van Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (LIW 167401), bladeren van Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), bladeren van Citrus limonium (ICN 167399), bladeren van Citrus reticulata (ICN 173127) en bladeren van Verbena sp. (ICN 167394). De voucher specimens werden gedeponeerd bij het herbarium van de Universidade Federal do Rio Grande do Sul (LIW).
2.3., Bereiding van plantenextracten
De verse plantenextracten werden bereid volgens traditioneel gebruik door inheemse volkeren door afkooksel bij 60°C gedurende 60 minuten . Waterige extracten werden gevriesdroogd en de werkoplossing werd bereid met 8,0 mg/mL in ultrapuur water, gesteriliseerd door filtratie (0,22 µm) en bewaard bij -20°C.
2.4. Anti-Trichomonas vaginalis Assay
tien waterige extracten werden in vitro onderzocht op activiteit tegen T. vaginalis. De test werd uitgevoerd in 96 microtiterplaten bij een eindconcentratie van 4,0 mg / mL in de putjes., De remmende minimumconcentratie (mic) werd bepaald met een achtvoudige verdunning (4,0–0,031 mg/mL) en de levensvatbaarheid van de trophozoieten werd bepaald volgens een fluorimetrische methode . Er werden twee controles uitgevoerd: negatieve controle alleen met trophozoieten en een positieve controle met 8,0 µM metronidazol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). De experimenten werden uitgevoerd in ten minste drie onafhankelijke experimenten, in drievoud. De resultaten werden uitgedrukt als het percentage levensvatbare trophozoieten in vergelijking met onbehandelde parasieten.
2.5., Groeieffect van waterige extracten
om het effect van de actieve waterige extracten op de groei van T. vaginalis te onderzoeken, werd een kinetische groeicurve uitgevoerd met behulp van het ATCC 30236 isolaat. De initiële dichtheid van de parasieten van 2,0 × 105 trofozoieten/mL werd geïncubeerd met de extracten bij MIC-waarde in TYM medium. De trophozoieten werden gedurende 72 uur met een hemocytometer geteld. de resultaten werden uitgedrukt als trophozoietgetal (105 / mL)., Voor microscopische analyse werden de controlegroepen en behandelde parasieten gedurende 10 minuten bij 2.000 toeren per minuut gecentrifugeerd om de organismen na 4 uur incubatie te concentreren, en het preparaat werd waargenomen in een lichtmicroscoop (vergroot ×1.000) door trypan blue dye exclusion.
2.6. Hemolytische bepaling
Deze bepaling werd uitgevoerd volgens de door Rocha et al. gebruikte methode. . Bloedgroep O positief van gezonde menselijke vrijwilligers werd verzameld met Alsever ‘ s Oplossing (1: 1) en gecentrifugeerd bij 2000 rpm gedurende 5 minuten. De erytrocytenfractie werd driemaal gewassen met PBS 1x (pH 7.,0) en geresuspendeerd tot 1% red cell suspension (v/v). De concentraties van waterige extracten werden gekozen op basis van de minimale remmende concentratie (mic) bepaald in de gevoeligheidstest. De erytrocyten werden geïncubeerd met de extracten bij 37°C onder roeren gedurende 1 uur en vervolgens gecentrifugeerd bij 3.000 rpm gedurende 5 minuten. De absorptie van het supernatans werd gemeten bij 540 nm. Het experiment werd uitgevoerd in drievoud, en het percentage hemolyse veroorzaakt door elk getest monster werd berekend in vergelijking met 100% hemolytische activiteit van saponine uit Quillaja saponaria .
3., Resultaten en discussie
Deze studie evalueerde de anti-T. vaginalis activiteit van waterige extracten van 10 medicinale planten die gebruikt worden in het medicijnsysteem Mbyá-Guarani. Onder de geteste planten vonden we twee waterige extracten met een krachtige anti-T. vaginalis in vitro activiteit. De veelbelovende extracten zijn van Verbena sp. en Campomanesia xanthocarpa. Het extract van Verbena sp. bij 4,0 mg/mL werd de optimale anti-T. vaginalis activiteit aangetoond die volledige cytotoxiciteit induceert (100% sterfte van parasieten) op alle afzonderlijke trichomonaden isolaten (figuur 1(a))., Het bladeren-extract van Campomanesia xanthocarpa vertoonde in dezelfde concentratie ook een zeer hoge anti-T. vaginalis-activiteit, waardoor de levensvatbaarheid van de parasiet tot 96% werd verminderd (figuur 1(b)).
andere waterige extracten vertoonden verschillende resultaten. Het waterige extract verkregen uit Bidens pilosa volledig afgeschaft de trophozoieten levensvatbaarheid alleen van het 30236 isolaat (figuur 1(c)). Het extract van de schors van Luehea divaricata leidde tot een andere vermindering van de levensvatbaarheid van T. vaginalis in elk getest trichomonads-isolaat (figuur 1(d))., De bladeren van Coix lacryma-jobi induceerden gemiddeld 75% van de vermindering van de levensvatbaarheid op T. vaginalis isolaten; voor het tv-LACH2 isolaat was de vermindering echter slechts 40% (figuur 1(e)). De verse klinische isolaten van mannelijke patiënten (TV-LACH1 en TV-LACH2) vertoonden een hogere gevoeligheid dan de isolaten van vrouwelijke patiënten (ATCC en fresh clinical) wanneer het wortelextract van Trichilia sp. is getest(figuur 1 (f)). Extracten van bladeren uit Citrus limonium verminderden de levensvatbaarheid van isolaten met ongeveer 40% (figuur 1(g))., De extracten van aloë arborescens en Citrus reticulata verminderden de levensvatbaarheid met 50% van ten minste één isolaat (figuur 1(h) en 1(i)), terwijl Rhipsalis baccifera de levensvatbaarheid van 30236 en TV-LACM2-isolaten met slechts 30% verminderde (figuur 1(j)).
in vergelijking met de andere extracten, de extracten van Verbena sp. en C. xanthocarpa toonde de meest veelbelovende activiteit tegen T. vaginalis, en de minimale remmende concentratie werd bepaald voor het 30236 isolaat (Tabel 1).,
|
|||||||||||||||||||||
om het effect van het meest actieve extract op de groei en levensvatbaarheid van parasieten te onderzoeken, werd een kinetische groeicurve uitgevoerd. De controle vertoonde de klassieke groeipiek na 24 uur incubatie; de organismen die werden behandeld met extracten van Verbena sp. en C., xanthocarpa, na 4 uur incubatie, riep een volledige groei afschaffing op (Figuur 2) en toonde een karakteristieke blauwe kleur door trypan blauwe kleurstof uitsluiting die celdood aangeeft (Figuur 3).
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(C) Campomanesia xanthocarpa
microscopische analyse van parasieten morfologie in lichtmicroscoop (vergroot ×1000) door trypan blue dye exclusion. a) controle; B)na 4 uur behandeling met waterig verbena sp.; c) na 4 uur behandeling met waterig extract van Campomanesia xanthocarpa.
om een mogelijk effect van de C. xanthocarpa en Verbena sp., extracten op parasietmembraan en ook om voorlopige gegevens over cytotoxiciteit tegen zoogdiercellen te hebben, werd hemolytische activiteit van deze extracten uitgevoerd. De Verbena sp. en C. xanthocarpa-extracten werden getest bij MIC-waarden en vertoonden respectievelijk 6,5 en 7,6% erytrocyten lysis (Tabel 1). Deze resultaten toonden aan dat beide extracten, bij MIC-waarden, geen significante hemolytische activiteit bevorderden, wat erop wijst dat het werkingsmechanisme dat verantwoordelijk is voor de vermindering van de levensvatbaarheid van de parasiet waarschijnlijk geen parasitaire membraanverstoring met zich meebrengt., Bovendien en belangrijk, deze bevindingen suggereren dat beide extracten zijn niet giftig voor zoogdiercellen, omdat ze niet menselijke erytrocyten lyse.
Deze studie draagt bij aan het redden van de inheemse kennis over medicinale planten. De inheemse Mbyá-Guarani gebruiken Verbena sp. (Guachu ka ‘ A in Mbyá-Guarani taal), als thee, voor de verlichting van symptomen van infectieziekten, zoals koorts. Dit is in overeenstemming met de literatuur die Verbena sp. infusie als kalmerend middel, pijnstillend aan ontstekingswanorde, huidbrandwonden, amenorroe, depressie, en maagziekten ., Bovendien heeft deze soort een verscheidenheid aan chemische bestanddelen, zoals flavonoïde, iridoid glycosiden, fenylpropanoid glycoside, sterolen, triterpenen en glycoconjugaat, en de biologische activiteit kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan hen . Daarnaast gebruikt deze stam de bladeren van C. xanthocarpa (Guavira in Mbyá-Guarani taal) voor de behandeling van diarree, maagpijn en wormen., Deze plant wordt traditioneel gebruikt in het zuiden van Brazilië als depuratief, antidiarrhoïc, reinigingsmiddel en antirheumatic, en om het bloedcholesterol te verlagen, en deze eigenschappen kunnen worden toegeschreven aan tannines , saponinen en flavonoïden (quercetine, myricetin, quercitrin en rutine), verbindingen aanwezig in de bladeren van C. xanthocarpa .
De rescue ethnofarmacologie van historische toepassingen van planten wordt erkend als waardevol voor bioprospectie, omdat zij de basis vormen voor selectie en onderzoek van medicinale planten ., Deze studie beschrijft het eerste rapport over de antiprotozoale activiteit van Verbena sp. en C. xanthocarpa. Daarnaast werden andere soorten van de families Verbenaceae en Myrtaceae getest tegen T. vaginalis, echter zonder succes . Verschillende biodiversiteiten en traditionele kennis van verschillende populaties hebben geleid tot onderzoek naar nieuwe prototypes anti-T. vaginalis. Onlangs werd het potentieel van planten die traditioneel van Caatinga worden gebruikt tegen T. vaginalis gemeld . Calzada et al., aangetoond dat planten gebruikt voor urogenitale aandoeningen in de Mexicaanse traditionele geneeskunde toonde effect tegen deze protozoa. Amaryllidaceae-soorten die in Zuid-Afrika tegen geslachtsziekten worden gebruikt, vertoonden ook veelbelovende activiteit tegen T. vaginalis .
gezien de impact van trichomonose op de volksgezondheid en het aantal resistente T. vaginalis isolaten, zijn er alternatieven nodig voor de behandeling van deze infectie. Natuurlijke producten zijn een veelbelovende bron van actieve moleculen, en de etnofarmacologie aanpak redt de kennis van de bevolking van medicinale planten., Deze wijsheid in combinatie met chemische en farmacologische studies presenteert een kostbare waarde in de bioprospectie van innovatieve, veilige en toegankelijke geneesmiddelen. Deze pioneer studie toonde relevante resultaten aan over de anti-T. vaginalis activiteit van de Verbena sp. en C. xanthocarpa, planten traditioneel gebruikt door de inheemse bevolking Mbyá-Guarani voor infectieziekten. Ondanks sterke anti-T. vaginalis activiteit, dit rapport redde de kennis van de inheemse bevolking, het vermijden van de miskraam van deze wijsheid.,
bijdrage van de auteurs
Clara Lia Costa Brandelli en Patrícia de Brum Vieira hebben eveneens aan dit werk bijgedragen.
bevestigingen
Dit werk werd ondersteund door het NANOBIOTEC-Brazil programma van CAPES and TAPERGS. De auteurs danken hoofdman José Cirilo Pires Morinico (stam Mbyá-Guarani), voor het mogelijk maken van de voltooiing van deze studie en voor de waardevolle informatie. Alexandre José Macedo en Tiana Tasca bedanken CNPq voor researcher fellowships.
Geef een reactie