A Beginner ‘ s Guide to Next Generation Sequencing (NGS) Technology

de voltooiing van het Human Genome Project in 2003 luidde een nieuw tijdperk in van snelle, betaalbare en nauwkeurige genoomanalyse—genaamd Next Generation Sequencing (NGS). NGS bouwt voort op” eerste generatie het rangschikken ” technologieën om nauwkeurige en rendabele het rangschikken resultaten op te leveren.

Fred Sanger sequenced het eerste volledige DNA genoom, de virusfaag ?X174, in 1977., In datzelfde jaar, ontwikkelde Sanger de toekomstige ruggengraat van het genoomtijdperk: het rangschikken van DNA technologie. Zijn techniek gebruikte de kettingbeëindigingsmethode. Dit wordt nu gezien als de” eerste generatietechnologie ” van genoom het rangschikken.

aangezien het rangschikken van Sanger (of de methode van de kettingbeëindiging) de eerste generatie van het rangschikken van technologie is, is het begrijpen van het zeer belangrijk. Het menselijke genoomproject begon met sanger die technologie rangschikken.,

de sanger-Sequencingmethode

De sanger-sequencingmethode berust op dideoxynucleotiden (ddNTPs),een type deoxynucleosidetrifosfaten (dNTPs), die geen 3′ – hydroxylgroep hebben en in plaats daarvan een waterstofatoom hebben . Wanneer deze basissen aan de groeiende opeenvolging van DNA binden, beëindigen zij replicatie aangezien zij andere basissen niet kunnen binden. Om sanger het rangschikken uit te voeren, voegt u uw inleidingen aan een oplossing toe die de genetische te rangschikken informatie bevatten, dan verdeel omhoog de oplossing in vier PCR reacties., Elke reactie bevat A met dntp mix met een van de vier nucleotiden gesubstitueerd met een ddntp (A, T, G, en C ddntp groepen). Aan het eind van PCR, zal elk van uw Vier reacties PCR-producten van diverse lengtes opleveren omdat de replicatie willekeurig wordt beëindigd. Door de monsters uit te voeren op een gel met 4 rijstroken, kunt u de sequentie samenvoegen omdat elke sequentie is gerepliceerd van hetzelfde originele materiaal. Hier is een voorbeeld waar de ddntps vetgedrukt zijn en de dNTPs niet:

uw reeks is ATGCTCAG.,

uw Vier reacties geven u:
reactie met ddATP: A, ATGCTCA, ATGCTCAG
reactie met ddGTP: ATG, ATGCTCAG
reactie met ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
reactie met ddTTP: AT, ATGCT, ATGCTCAG

:

elke band geeft de code van verschillende lengtes aan. Bijvoorbeeld, de band is de juiste onder de “A” symboliseert de volgorde: “ATGCTCA”

nog steeds verward?

laten we ons een partijspel voorstellen. Het spel is een raadspel., Hier is hoe het gespeeld wordt:

u denkt aan een getal en de groep moet het raden. Het lastige is dat het getal 200-cijfers lang is. Je leest de cijfers van het nummer in je hoofd zonder een geluid te maken. Af en toe onderbreekt een persoon je, en je vertelt hen het enkele cijfer waar je net aan dacht en waar het is in de volgorde van 200. Elke keer dat je onderbroken wordt, moet je opnieuw beginnen. Je vertrekt na een paar uur en de groep moet het 200-cijferige getal achterhalen., Ze moeten de informatie die je hen gaf bij elkaar zetten, bijvoorbeeld het 25e nummer was 5, het 40e nummer was 0, enzovoort. Met behulp van de informatie van hun onderbrekingen, kunnen ze het nummer herhalen dat ze je gaven.

hoewel dit klinkt als het stomste spel in de wereld, het werkt zeer goed voor sequencing!

helaas is het traag, duur en (voorheen) afhankelijk van radioactief materiaal. Dit duwde wetenschappers om nieuwe en betere vormen van genoom het rangschikken te ontwikkelen.,

Next Generation Sequencing Technologies

de grootste vooruitgang op het gebied van genoomsequencing heeft geleid tot een toename van de snelheid en nauwkeurigheid, wat heeft geleid tot een vermindering van de mankracht en de kosten. De snelheid is te danken aan parallelle analyse en high throughput technologie. Het is het verschil tussen het krijgen van een 4-jarige om Moby Dick te lezen en het geven van een paragraaf elk aan een stelletje Drama majors en hen te vragen om te lezen in een keer.

Sequencing machines zijn Wild verbeterd sinds Sanger zijn methode ontwikkelde., In 1987 werd Applied Biosystems de eerste die een automatische sequencingmachine introduceerde, genaamd AB370. De machine baseerde zich op een methode genoemd capillaire elektroforese die de ketting van Sanger gebruikte beëindigende methode zonder een gel te vereisen.

fluorescerend geëtiketteerde keten-eindigende ddNTPs worden toegevoegd aan de PCR-reactiemix. Door sanger die methode rangschikken, worden PCR-producten van diverse lengtes gecreeerd, en dan volgens hun grootte gescheiden. De grootte wordt gemeten door de totale negatieve last van het PCR-product. Hoe negatiever de lading, hoe langer het fragment., Neem het bovenstaande voorbeeld van ddntp incorporatie en stel je voor dat de vetgedrukte letters ddntps zijn met een fluorochrome bijgevoegd. Aangezien de fragmenten naar de positieve elektrode van een capillair worden getrokken (zie afbeelding hieronder), passeren zij een laserstraal die een lichtflits van fluorochroom in bijlage aan de ddntp triggers die kenmerkend is voor het basistype (bijvoorbeeld, groen voor A, geel voor T, blauw voor G, rood voor C). Op deze manier wordt het genoom zorgvuldig gelezen.

het grootste verschil was hier snelheid en kosten., AB370 kon 96 basissen in één keer ontdekken, 500K basissen per dag, en had een gelezen lengte van 600 basissen door een parallelle analyse en hoge productieopstelling te gebruiken. Deze vorm van het rangschikken werd het belangrijkste hulpmiddel voor de voltooiing van het menselijke genoomproject.

hoe verhoudt NGS zich tot de eerste generatie Sequencing?

NGS wordt gekenmerkt door een verbeterde nauwkeurigheid en snelheid, maar ook door verminderde mankracht en kosten. Er is nog nooit een tijd geweest waarin het zo goedkoop, handig of eenvoudig was om een genoom te sequencen., Aantoonbaar, is de grootste verbetering de ontwikkeling van parallelle analyse geweest, die de het rangschikken snelheid verhoogde.

het enige wat ons nu vertraagt is de interpretatie van de resultaten!