7.13 F: DNA-Sequencing op basis van Sanger Dideoxynucleotiden

Sanger sequencing, ook bekend als chain-termination sequencing, verwijst naar een methode voor DNA-sequencing ontwikkeld door Frederick Sanger in 1977. Deze methode is gebaseerd op versterking van het fragment van DNA dat door de polymerase van DNA en integratie van gewijzigde nucleotiden moet worden gerangschikt – specifiek, dideoxynucleotiden (ddNTPs).,

De klassieke keten-terminatiemethode vereist een enkelstrengs DNA-sjabloon, een DNA-primer, een DNA-polymerase, normale deoxynucleotidetrifosfaten (dNTPs) en gemodificeerde nucleotiden (dideoxyNTPs) die de verlenging van de DNA-streng beëindigen. Deze ketting-eindigende nucleotiden missen een 3 ‘ – OH groep die voor de vorming van een phosphodiesterband tussen twee nucleotiden wordt vereist, veroorzakend de polymerase van DNA om uitbreiding van DNA te beëindigen wanneer een ddntp wordt opgenomen. De ddNTPs kunnen radioactief of fluorescerend worden geëtiketteerd voor detectie in geautomatiseerde sequencingmachines.,De steekproef van DNA is verdeeld in vier afzonderlijke het rangschikken reacties, die alle vier van de standaarddeoxynucleotiden (dATP, dGTP, dCTP en dTTP) en de polymerase van DNA bevatten. Aan elke reactie wordt slechts één van de vier dideoxynucleotiden (ddATP, ddGTP, ddCTP, of ddTTP) toegevoegd. Na rondes van de uitbreiding van malplaatjedna van de verbindende inleiding, zijn de resulterende fragmenten van DNA hitte gedenatureerd en gescheiden door Grootte gebruikend gelelektroforese. Dit wordt vaak uitgevoerd met behulp van een denaturerende polyacrylamide-ureum gel waarbij elk van de vier reacties loopt in een van de vier afzonderlijke rijstroken (rijstroken A, T, G, C)., De banden van DNA kunnen dan door autoradiografie of UV-licht worden gevisualiseerd en de opeenvolging van DNA kan direct van de röntgenfilm of het gelbeeld worden gelezen.

technische variaties in de sequencing van ketenbeëindiging omvatten het merken met nucleotiden die radioactief fosfor bevatten voor radioactief labelen, of het gebruik van een primer met een fluorescerende kleurstof aan het uiteinde van 5′. Dye-primer sequencing vergemakkelijkt het lezen in een optisch systeem voor snellere en meer economische analyse en automatisering. De latere ontwikkeling door Leroy Hood en collega ‘ s van fluorescently geëtiketteerde ddNTPs en inleidingen zette het stadium voor het geautomatiseerde, hoog-productiedna rangschikken. De methodes van de ketting-beëindiging hebben het rangschikken van DNA zeer vereenvoudigd., Meer recent, is het kleurstof-terminator rangschikken ontwikkeld. Kleurstof-terminator het rangschikken gebruikt etikettering van de ketting terminator ddNTPs, die het rangschikken in één enkele reactie, eerder dan vier reacties zoals in de geëtiketteerd-inleidingsmethode toestaat. Bij het rangschikken van de kleurstof-terminator, wordt elk van de vier dideoxynucleotide-ketting terminators geëtiketteerd met fluorescente kleurstoffen, die elk licht bij verschillende golflengten uitzenden.,

geautomatiseerde DNA-sequencing-instrumenten (DNA-sequencers) kunnen tot 384 DNA-monsters in een enkele batch (run) in maximaal 24 runs per dag sequencen., De sequencers van DNA voeren capillaire elektroforese voor groottescheiding, opsporing en registratie van kleurstoffluorescentie, en gegevensoutput uit als fluorescente piekspoor chromatogrammen. De automatisering heeft tot het rangschikken van volledige genomen geleid.