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TESTO

Natalizumab, un anticorpo usato per trattare la sclerosi multipla recidivante (SM), previene il traffico di linfociti attivati, inclusi i linfociti autoreattivi, attraverso la barriera emato-encefalica (BBB). Il principale effetto avverso di natalizumab è la leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML), una devastante malattia demielinizzante causata dalla replicazione del poliomavirus umano JC (JCV) in oligodendrociti e astrociti (1, 2)., L’inibizione di Natalizumab del traffico di cellule T effettrici dal sangue al sistema nervoso centrale (SNC) potrebbe favorire la replicazione locale del JCV (3-7).

Qui, abbiamo esaminato la presenza di cellule T di memoria effettrice specifiche di JCV (TEM) nel sangue dei pazienti con SM dopo l’attivazione notturna dell’antigene ex vivo. In vivo, i numeri specifici di TEM diminuiscono una volta eliminato l’antigene affine (8-10) e la loro presenza può quindi indicare una replicazione JCV in corso. TEM rilascia rapidamente citochine come l’interferone gamma (IFN-γ) quando riesposto all’antigene., Un precedente saggio immunoassorbente spot (ELISPOT) legato all’enzima ha esaminato l’espressione di IFN-γ nelle cellule T dopo attivazione a lungo termine con peptidi JCV per un massimo di 14 giorni (11). Tuttavia, l’attivazione prolungata consente di riattivare e espandere la memoria delle cellule T quiescenti a lungo termine, il che significa che una risposta positiva non significa necessariamente una risposta immunitaria in corso. Qui, abbiamo prima esaminato la presenza di TEM specifico per JCV in due pazienti con SM che hanno sviluppato PML. Al primo paziente è stata diagnosticata la PML dopo 39 mesi di natalizumab (39 infusioni) (Dipartimento di Neurologia, Ospedale Pitié-Salpétrière)., Aveva 39 anni e aveva una storia di 10 anni di sclerosi multipla recidivante-remittente. Prima di natalizumab, aveva ricevuto ciclofosfamide e mitoxantrone. La PML è stata confermata da MRI e PCR JCV sul liquido cerebrospinale (CSF). Quando testato per JCV-specifica TEM, 8 settimane dopo PML insorgenza dei sintomi, aveva 1.040 copie del genoma JCV per ml di CSF (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Diagnostica avanzata). Le sue cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state attivate in vitro in mezzo AIM-V e Albumax (Invitrogen) per 16 h con JCV purificato (ceppo MAD-4; LGC Promochem; 104,5 50% dose infettiva di coltura tissutale /0,2 ml)., Non è stata aggiunta interleuchina 2 ricombinante (IL-2). Una quantità di virus corrispondente a 5.534 PFU è stata aggiunta a ciascun pozzetto. Ciò corrispondeva a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,02. Le cellule sono state quindi testate per l’IFN-γ intracellulare mediante citometria a flusso. La mortalità cellulare dopo attivazione notturna è stata inferiore al 5%. Come mostrato in Fig. 1A e andB, B, le cellule rispondenti sono state rilevate in entrambi i sottoinsiemi di cellule T CD4 e CD8 e la maggior parte di esse aveva la caratteristica del fenotipo CCR7− CD45RA degli effettori di memoria (12)., Anti-JCV TEM sono stati rilevati anche da IFN-γ ELISPOT (cattura e rilevamento anticorpi, cloni 1-D1 e K7-B6-1, rispettivamente; Mabtech) dopo 16 ore di attivazione con peptidi purificati JCV o VP-1 (un mix di 14 pool di peptidi sovrapposti a 15 aminoacidi che coprono l’intera proteina JCV VP-1 ) (Fig. 1C). La seconda paziente aveva 46 anni e aveva una storia di 11 anni di sclerosi multipla recidivante-remittente.Prima di natalizumab, aveva ricevuto interferone beta, glatiramer acetato, azatioprina e mitoxantrone. È stata indirizzata al centro MS dell’ospedale Tenon per la rivalutazione dopo le infusioni di natalizumab 24., Una risonanza magnetica cerebrale eseguita nel maggio 2012 ha rilevato una piccola lesione sospetta lineare T2-iperintensa nella regione frontale destra juxtacortical. Il primo campione di CSF è risultato negativo per JCV. La risonanza magnetica ripetuta dopo la sospensione di natalizumab ha rivelato un aumento della dimensione della lesione, portando a due ulteriori esami del liquido cerebrospinale, entrambi negativi per il JCV. La PCR di JCV su plasma è stata eseguita 2 e 4 mesi dopo l’inizio della PML. Entrambi i campioni di plasma erano negativi. La biopsia cerebrale eseguita nel settembre 2012 ha finalmente confermato la diagnosi di PML.,

L’analisi ELISPOT della risposta IFN-γ a JCV, eseguita 2 giorni dopo l’ultima infusione di natalizumab, ha mostrato la presenza di TEM specifico per JCV nel sangue (Fig. 1C). È interessante notare che i numeri di TEM specifici del JCV circolanti erano inferiori rispetto al primo paziente PML, che potrebbe aver avuto un livello più alto di replicazione del JCV nel cervello, poiché la PCR del JCV sul CSF era positiva nel primo paziente e negativa nel secondo.,

Abbiamo anche esaminato la presenza di TEM JCV-specifica di ELISPOT in una serie di 62 pazienti con SM con SM recidivante-remittente trattati con natalizumab secondo i termini di marketing europei, così come in 35 pazienti con SM che non ricevevano alcuna terapia modificante la malattia e in un gruppo di 40 donatori sani abbinati per età e sesso con pazienti con SM. Le caratteristiche dei pazienti con SM sono riportate nella Tabella 1. I pazienti e i donatori sani hanno dato il loro consenso scritto a partecipare allo studio, che è stato approvato dal comitato etico dell’Ospedale Pitié-Salpêtrière, Parigi., Una risposta ELISPOT è stata considerata positiva se il numero corretto di macchie (numero di macchie nei pozzetti attivati meno numero di macchie nei pozzetti non trattati) è stato almeno 10, con meno di 10 macchie nei pozzetti non trattati.

La percentuale di campioni positivi è stata del 2,5% nei donatori sani (Fig. 2 BIS). Nel gruppo MS, la percentuale di pazienti positivi è aumentata con il tempo di natalizumab (Fig. 2B e andC), C), dall’8,8% nei pazienti non trattati con SM al 15,9% tra i pazienti trattati con natalizumab per meno di 24 mesi e al 27% tra i pazienti trattati per più di 24 mesi (Fig., 2C) (significativo per i pazienti trattati per più di 24 mesi rispetto alla SM non trattata e rispetto ai soggetti di controllo). Questo aumento nella frequenza di rilevazione delle risposte di JCV TEM ha suggerito che il trattamento prolungato di natalizumab ha favorito la riattivazione di JCV.

Un sottoinsieme di pazienti trattati con natalizumab è stato prelevato almeno due volte (vedere Tabella 1). Come mostrato in Fig. 2D, la maggior parte di questi pazienti è diventata o è rimasta positiva durante il periodo di campionamento.,

Il rene è un importante serbatoio per JCV. Una percentuale significativa della popolazione generale espelle il virus nelle urine ma non ha evidenza di JCV nel sangue (13-15). Inoltre, la presenza di DNA JCV nel cervello sembra essere indipendente dalla sua presenza nel rene (16). Come mostrato in Fig. 2E, il 60% dei pazienti con SM con JCV TEM rilevabile nel sangue non aveva JCV rilevabile nelle urine e il 69% dei pazienti con PCR JCV positiva nelle urine non aveva JCV TEM rilevabile. L’escrezione urinaria di JCV senza JCV TEM rilevabile è stata osservata anche in donatori sani (Fig. 2E)., Ciò suggerisce che la presenza di replicazione del JCV nel rene non porta necessariamente a JCV TEM rilevabile nel sangue. Al contrario, ciò solleva la possibilità che la rilevazione di JCV TEM nel sangue possa riflettere la replicazione extrarenale in corso di JCV.

In uno studio con un nuovo metodo ELISA (JCV enzyme-linked immunosorbent assay) (17), la sieroprevalenza stimata del JCV nei pazienti con SM trattati con natalizumab è stata del 53,6% (17). La sieropositività non è necessariamente correlata alla presenza di risposte TEM, che è correlata alla riattivazione del virus., Le plasmacellule a vita lunga possono persistere nel midollo osseo per lunghi periodi di tempo, forse per decenni, mantenendo titoli anticorpali sierici sostenuti senza replicazione attiva del patogeno (18, 19). Abbiamo usato lo stesso metodo ELISA per testare 56 dei nostri pazienti con SM trattati con natalizumab che erano stati testati da JCV ELISPOT, inclusi i 2 pazienti con PML. Come mostrato in Fig. 2F, il 53,6% dei pazienti era sieropositivo e il 16,1% era positivo a ELISPOT. Il ventisette per cento dei pazienti sieropositivi con JCV aveva una JCV TEM rilevabile nel sangue. Solo un paziente positivo a JCV ELISPOT è risultato sieronegativo., Secondo Gorelik et al., il tasso falso-negativo dell’analisi sierologica di JCV è 2.5% (17).

I nostri risultati mostrano che la frequenza di rilevazione delle risposte di JCV TEM nei pazienti con SM aumenta con il tempo di natalizumab. Uno studio precedente ha anche mostrato un aumento delle risposte delle cellule T al JCV dopo 12 mesi di terapia con natalizumab, ma questo studio è stato limitato a 18 mesi di trattamento (20), mentre abbiamo scoperto che il più forte aumento delle risposte delle cellule T effettori si è verificato dopo 24 mesi.,

I nostri risultati indicano quindi la riattivazione del JCV durante la terapia con natalizumab, anche in siti extrarenali. JCV è stato rilevato nel cervello di individui HIV-sieronegativi senza PML (21). La ridotta immunosuperficie del SNC indotta da natalizumab potrebbe favorire la riattivazione locale del virus che può iniziare come replicazione del virus intermittente asintomatica, ma potrebbe evolvere verso la replicazione del virus sostenuta e quindi verso la PML. La riattivazione del virus potrebbe attivare linfociti T specifici periferici, tramite cellule che presentano antigene, in posizioni come i linfonodi cervicali drenanti dal cervello (22-24)., Poiché natalizumab si rivolge al recettore VLA-4, queste cellule specifiche non possono attraversare efficacemente la barriera emato-encefalica e potrebbero quindi accumularsi nel sangue, facilitando la loro individuazione. La PML è anche una complicazione dell’infezione da HIV in fase avanzata. Se il rilevamento delle cellule T CD4 e CD8 effettori specifici di JCV possa precedere la PML associata all’AIDS è un punto di interesse che merita ulteriori indagini. Tuttavia, la PML associata all’AIDS è chiaramente diversa dalla PML indotta da natalizumab., La maggior parte dei pazienti con infezione da HIV che sviluppano PML ha una profonda linfopenia CD4, che altera anche la funzionalità delle cellule T CD8 attraverso la mancanza di aiuto CD4 (25). Inoltre, a differenza dei pazienti trattati con natalizumab, non vi è alcun blocco del traffico di cellule T attraverso la barriera emato-encefalica, e ciò può prevenire l’accumulo di TEM specifico per JCV nel sangue.

Insieme, i nostri risultati suggeriscono che saggi funzionali in grado di rilevare le risposte TEM specifiche per JCV potrebbero aiutare a identificare i pazienti a rischio di sviluppare PML durante il trattamento con anticorpi che inibiscono il traffico linfocitario attraverso la barriera emato-encefalica.,