Abstract
Trichomonas vaginalis, un protozoo flagellato, è l’agente eziologico della trichomonosi, la più comune malattia a trasmissione sessuale non virale in tutto il mondo. Tenendo conto dell’aumentata prevalenza di isolati resistenti al metronidazolo, i farmaci alternativi sono essenziali per il successo del trattamento. I prodotti naturali sono la fonte della maggior parte dei nuovi farmaci e la saggezza popolare sull’uso delle piante medicinali è uno strumento potente in questa ricerca., In questo studio, l’attività di 10 piante medicinali ampiamente utilizzate nella vita quotidiana dal gruppo indigeno Mbyá-Guarani è stata valutata rispetto a sette diversi isolati di T. vaginalis. Tra gli estratti acquosi testati, Verbena sp. (Guachu ka’a in lingua Mbyá-Guarani) e Campomanesia xanthocarpa (Guavira in lingua Mbyá-Guarani) hanno mostrato la più alta attività contro T. vaginalis con valore MIC di 4,0 mg/mL raggiungendo il 100% di efficacia contro il parassita. I test di crescita cinetica hanno dimostrato che gli estratti hanno promosso l’abolizione completa della crescita dopo 4 ore di incubazione., Inoltre, gli estratti testati non hanno promosso una significativa attività emolitica contro gli eritrociti umani. I nostri risultati mostrano per la prima volta la potenziale attività di Verbena sp. e C. xanthocarpa contro T. vaginalis. Inoltre, questo studio dimostra che la conoscenza indigena è una fonte importante di nuovi agenti antiprotozoari prototipo.
1. Introduzione
Trichomonas vaginalis parassita il tratto umano urogenitale causando trichomonosis, la malattia sessualmente trasmessa non virale più diffusa in tutto il mondo, essendo responsabile di 248 milioni di nuovi casi ogni anno ., Dopo la colonizzazione, il parassita causa vaginite, uretrite e prostatite . Inoltre, l’agente patogeno è stato associato a gravi conseguenze come esiti avversi di gravidanza e parto pretermine , infertilità , predisposizione al cancro cervicale e malattia infiammatoria pelvica . È importante sottolineare che la trichomonosi agisce come cofattore nella trasmissione e nell’acquisizione del virus dell’immunodeficienza umana (HIV). Nonostante l’impatto di questa infezione, l’arsenale terapeutico sta limitando, e solo metronidazolo e tinidazolo, entrambi i farmaci 5-nitroimidazolo, sono approvati dalla FDA per il trattamento della trichomonosi ., Sebbene il tasso di cura sia alto, il fallimento del trattamento può essere osservato e la resistenza degli isolati di T. vaginalis è la ragione principale del fallimento del trattamento . In questo senso, è indubbiamente necessario che lo studio di nuove alternative per il trattamento della tricomonosi e due strategie possano essere seguite: (i) la ricerca di nuovi bersagli terapeutici, che è essenziale per lo sviluppo razionale di nuovi agenti antiparassitari e (ii) lo studio di nuovi anti-T., vaginalis composti strutturalmente distinti da 5-nitroimidazoli e, di conseguenza, agendo da meccanismo diverso come dimostrato dal nostro gruppo .
In questo contesto, i prodotti naturali, in particolare le piante medicinali, sono incommensurabili come una potente fonte di molecole bioattive. Sin dai tempi antichi, le persone usano le piante per trattare le malattie infettive comuni e alcune di queste medicine tradizionali sono ancora integrate come parte della cura di diverse patologie . Inoltre, la ricerca basata su informazioni etnofarmacologiche salva l’immensa conoscenza empirica dell’utilizzo delle piante ., In questo contesto, per quanto riguarda l’ambiente naturale e la vasta ricchezza di risorse genetiche, il Brasile è un paese di grande interesse per l’etnofarmacologia .
Gli indigeni hanno una ricchezza di informazioni sulla biodiversità e sanno come catturare e utilizzare le risorse naturali . Nonostante il fatto che diversi farmaci siano stati scoperti attraverso cure tradizionali e conoscenze popolari, in Brasile ci sono 122 gruppi etnici indigeni, ma solo il 30% di loro è stato studiato per quanto riguarda gli aspetti etnobotanici ., Pertanto, lo studio delle piante utilizzate dalla medicina indigena è importante per interconnettere la medicina tradizionale e l’ambiente biotico preservando le antiche conoscenze indigene.
I protozoi parassiti rimangono una grave minaccia per la salute umana e animale, e ci sono pochi farmaci efficaci per il trattamento di molte malattie protozoi. Tenendo conto dell’etnofarmacologia indigena come contributore allo screening sistematico di piante con attività antiprotozoica, questo studio ha valutato l’anti-T., vaginalis attività delle più importanti piante medicinali utilizzate in Mbyá-Guarani medicina indigena situata nel sud del Brasile.
2. Materiali e metodi
2.1. Condizioni di coltura del parassita
In questo studio, sette isolati di T., vaginalis sono stati utilizzati: 30236 e 30238 da American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV-LACM2 e TV-LACM3 (fresco clinici isolati da pazienti di sesso femminile); TV-LACH1 e TV-LACH2 (fresco clinici isolati da pazienti di sesso maschile) tutti da Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brasile (progetto etico approvazione UFRGS Etico Comitato di Ricerca, numero di 18923). I trichomonadi sono stati coltivati axenicamente in tripticasi-estratto di lievito-mezzo di maltosio (TYM) (pH 6.0), integrati con siero bovino inattivato al 10% e incubati a 37°C.
2.2., Materiale vegetale
Il materiale vegetale è stato raccolto dalla tribù indigena Mbyá-Guarani situata a Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brasile (30°06’47.62″ S e 51°07’37.85″ O), nel marzo 2011. Questo villaggio è denominato Tekoá Anhetenguá (in inglese, Vero Villaggio), e 200 persone vivono nella zona riunite in 40 famiglie. Le donne del villaggio hanno la conoscenza delle piante medicinali utilizzate da tutta la popolazione e hanno condotto la raccolta di esemplari. Sono state raccolte dieci piante utilizzate abitualmente nella medicina indigena per le malattie infettive: foglie di Aloe arborescens Mill., (ICN 173371), parti aeree di Bidens pilosa L. (ICN 167397), parti aeree di Rhipsalis baccifera (ICN 167402), cortecce di Luehea divaricata (ICN 167403), radici di Trichilia sp. (ICN 173126), foglie di Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), foglie di Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), foglie di Citrus limonium (ICN 167399), foglie di Citrus reticulata (ICN 173127) e foglie di Verbena sp. (ICN 167394). I campioni voucher sono stati depositati presso l’erbario della Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN).
2.3., Preparazione di estratti vegetali
Gli estratti di piante fresche sono stati preparati secondo l’uso tradizionale da parte degli indigeni mediante decozione a 60°C per 60 min . Gli estratti acquosi sono stati liofilizzati e la soluzione di lavoro è stata preparata a 8,0 mg/mL in acqua ultrapura, sterilizzata per filtrazione (0,22 µm) e conservata a -20°C.
2,4. Test anti-Trichomonas vaginalis
Dieci estratti acquosi sono stati sottoposti a screening in vitro per l’attività contro T. vaginalis. Il test è stato eseguito in 96 piastre di microtitolazione alla concentrazione finale di 4,0 mg / mL nei pozzetti., La concentrazione minima inibitoria (MIC) è stata determinata utilizzando una diluizione di otto volte (4,0–0,031 mg/ml) e la vitalità dei trofozoiti è stata determinata secondo un metodo fluorimetrico . Sono stati eseguiti due controlli: un controllo negativo solo con trofozoiti e un controllo positivo con 8,0 µM di metronidazolo (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Stati Uniti d’America). Gli esperimenti sono stati eseguiti almeno in tre esperimenti indipendenti, in triplice copia. I risultati sono stati espressi come percentuale di trofozoiti vitali rispetto ai parassiti non trattati.
2.5., Effetto di crescita degli estratti acquosi
Al fine di studiare l’effetto degli estratti acquosi attivi sulla crescita di T. vaginalis, è stata eseguita una curva di crescita cinetica utilizzando l’isolato ATCC 30236. La densità iniziale dei parassiti di 2,0 × 105 trofozoiti / mL è stata incubata con gli estratti a valore MIC nel mezzo TYM. I trofozoiti sono stati contati utilizzando un emocitometro durante 72 h. I risultati sono stati espressi come numero di trofozoiti (105 / mL)., Per l’analisi microscopica, i controlli e i parassiti trattati sono stati centrifugati per 10 min a 2.000 giri / min per concentrare gli organismi dopo 4 ore di incubazione e la preparazione è stata osservata al microscopio ottico (ingrandita ×1.000) mediante esclusione del colorante blu trypan.
2.6. Test emolitico
Questo test è stato eseguito secondo il metodo utilizzato da Rocha et al. . Il gruppo sanguigno O positivo da volontari umani sani è stato raccolto con la soluzione di Alsever (1 : 1) e centrifugato a 2.000 giri / min per 5 min. La frazione eritrocitaria è stata lavata tre volte con PBS 1x (pH 7.,0) e risospeso per dare 1% sospensione eritrocitaria (v/v). Le concentrazioni degli estratti acquosi sono state scelte in base alla concentrazione minima inibitoria (MIC) determinata nel saggio di suscettibilità. Gli eritrociti sono stati incubati con gli estratti a 37°C sotto agitazione per 1 ora e poi sono stati centrifugati a 3.000 giri / min per 5 min. L’assorbanza del surnatante è stata misurata a 540 nm. L’esperimento è stato eseguito in triplice copia e la percentuale di emolisi causata da ciascun campione testato è stata calcolata rispetto all’attività emolitica del 100% della saponina di Quillaja saponaria .
3., Risultati e discussione
Questo studio ha valutato l’attività anti-T. vaginalis di estratti acquosi di 10 piante medicinali utilizzate nel sistema di medicina Mbyá-Guarani. È importante sottolineare che, tra le piante testate, abbiamo trovato due estratti acquosi con una potente attività anti-T. vaginalis in vitro. Gli estratti promettenti sono di Verbena sp. e Campomanesia xanthocarpa. L’estratto di Verbena sp., a 4,0 mg/mL, ha dimostrato l’attività ottimale anti-T. vaginalis che induce citotossicità completa (100% della morte dei parassiti) su tutti gli isolati distinti di trichomonads(Figura 1 (a))., Anche l’estratto di foglie di Campomanesia xanthocarpa alla stessa concentrazione ha mostrato un’attività anti-T. vaginalis molto elevata, riducendo la vitalità del parassita fino al 96% (Figura 1 (b)).
Altri estratti acquosi hanno mostrato una varietà di risultati. L’estratto acquoso ottenuto da Bidens pilosa ha completamente abolito la vitalità dei trofozoiti solo dell’isolato 30236 (Figura 1, lettera c)). L’estratto delle cortecce di Luehea divaricata ha indotto una riduzione della vitalità di T. vaginalis in modo diverso in ciascun isolato di trichomonads testato (Figura 1 (d))., Le foglie di Coix lacryma-jobi hanno indotto, in media, il 75% della riduzione della vitalità sugli isolati di T. vaginalis; tuttavia, per l’isolato TV-LACH2, la riduzione è stata solo del 40% (Figura 1(e)). Gli isolati clinici freschi di pazienti di sesso maschile (TV-LACH1 e TV-LACH2) hanno presentato una maggiore suscettibilità rispetto agli isolati di pazienti di sesso femminile (ATCC e fresh clinical) quando l’estratto di radice di Trichilia sp. è stato testato (Figura 1 (f)). Gli estratti di foglie di Citrus limonium hanno ridotto di circa il 40% la vitalità degli isolati (Figura 1(g))., Gli estratti di Aloe arborescens e Citrus reticulata hanno ridotto la vitalità del 50% di almeno un isolato (Figure 1(h) e 1(i)), mentre Rhipsalis baccifera ha ridotto solo del 30% la vitalità degli isolati 30236 e TV-LACM2 (Figura 1(j)).
Rispetto agli altri estratti, gli estratti di Verbena sp. e C. xanthocarpa ha dimostrato l’attività più promettente contro T. vaginalis e la concentrazione inibitoria minima è stata determinata per l’isolato 30236 (Tabella 1).,
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Al fine di studiare l’effetto dell’estratto più attivo sulla crescita e sulla vitalità dei parassiti, è stata eseguita una curva di crescita cinetica. Il controllo ha mostrato il classico picco di crescita dopo 24 h di incubazione; tuttavia, gli organismi trattati con estratti di Verbena sp. e C., xanthocarpa, dopo 4 ore di incubazione, ha evocato una completa abolizione della crescita (Figura 2) e ha mostrato un caratteristico colore blu per esclusione del colorante blu tripano che indica la morte cellulare (Figura 3).
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(c) Campomanesia xanthocarpa
Al fine di indagare un possibile effetto del C. xanthocarpa e Verbena sp., estratti sulla membrana dei parassiti e anche per avere dati preliminari sulla citotossicità contro le cellule di mammifero, è stata condotta l’attività emolitica di questi estratti. La Verbena sp. e gli estratti di C. xanthocarpa sono stati testati a valori MIC e hanno dimostrato la lisi degli eritrociti del 6,5 e del 7,6%, rispettivamente (Tabella 1). Questi risultati hanno dimostrato che entrambi gli estratti, a valori MIC, non promuovevano una significativa attività emolitica, indicando che il meccanismo d’azione responsabile della riduzione della vitalità del parassita probabilmente non comporta la rottura della membrana parassitaria., Inoltre, e soprattutto, questi risultati suggeriscono che entrambi gli estratti non sono tossici per le cellule di mammifero, poiché non hanno lisato gli eritrociti umani.
Questo studio contribuisce a salvare le conoscenze indigene sulle piante medicinali. Gli indigeni Mbyá-Guarani usano Verbena sp. (Guachu ka’a in lingua Mbyá-Guarani), come tè, per il sollievo dei sintomi di malattie infettive, come la febbre. Questo è in accordo con la letteratura che riguarda Verbena sp. infusione come sedativo, analgesico per disturbi infiammatori, ustioni cutanee, amenorrea, depressione e malattie gastriche ., Inoltre, questa specie ha una varietà di costituenti chimici, come flavonoidi, glicosidi iridoidi, glicosidi fenilpropanoidi, steroli, triterpeni e glicoconiugato, e l’attività biologica può essere parzialmente attribuita a loro . Inoltre, questa tribù utilizza le foglie di C. xanthocarpa (Guavira in lingua Mbyá-Guarani) per il trattamento di diarrea, mal di stomaco e vermi., Questa pianta è tradizionalmente utilizzata nel sud del Brasile come depurativo, antidiarroico, detergente e antireumatico e per diminuire il colesterolo nel sangue, e queste proprietà possono essere attribuite a tannini , saponine e flavonoidi (quercetina, miricetina, quercitrina e rutina), composti presenti nelle foglie di C. xanthocarpa .
L’etnofarmacologia di salvataggio degli usi storici delle piante è riconosciuta come preziosa per la bioprospezione, poiché offre la logica per la selezione e la ricerca delle piante medicinali ., Questo studio descrive il primo rapporto sull’attività antiprotozoaria della Verbena sp. e C. xanthocarpa. Inoltre, altre specie delle famiglie Verbenaceae e Myrtaceae sono state testate contro T. vaginalis, tuttavia, senza successo . Diverse biodiversità e conoscenze tradizionali di diverse popolazioni hanno guidato gli studi alla ricerca di nuovi prototipi anti-T. vaginalis. Recentemente, è stato riportato il potenziale delle piante tradizionalmente utilizzate da Caatinga contro T. vaginalis . Calzada et al., dimostrato che le piante utilizzate per i disturbi del tratto urogenitale nella medicina tradizionale messicana hanno mostrato effetto contro questo protozoo. Le specie di Amaryllidaceae utilizzate contro le malattie veneree in Sud Africa hanno mostrato anche un’attività promettente contro T. vaginalis .
Considerando l’impatto della tricomonosi nella salute pubblica e il numero emergente di isolati resistenti di T. vaginalis, sono necessarie alternative per il trattamento di questa infezione. I prodotti naturali sono una fonte promettente di molecole attive e l’approccio etnofarmacologico salva la conoscenza della popolazione di piante medicinali., Questa saggezza combinata con studi chimici e farmacologici presenta un valore prezioso nella bioprospezione di farmaci innovativi, sicuri e accessibili. Questo studio pionieristico ha dimostrato risultati rilevanti sull’attività anti-T. vaginalis della Verbena sp. e C. xanthocarpa, piante tradizionalmente utilizzate dalla popolazione indigena Mbyá-Guarani per le malattie infettive. Nonostante abbia mostrato una forte attività anti-T. vaginalis, questo rapporto ha salvato la conoscenza degli indigeni, evitando l’aborto di questa saggezza.,
Contributo degli autori
Clara Lia Costa Brandelli e Patrícia de Brum Vieira hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato supportato dal programma NANOBIOTEC-Brasile di CAPES e FAPERGS. Gli autori ringraziano il capo José Cirilo Pires Morinico (tribù Mbyá-Guarani), per aver reso possibile la realizzazione di questo studio e per le preziose informazioni. Alexandre José Macedo e Tiana Tasca ringraziano CNPq per borse di ricerca.
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