Nelle cellule e in laboratorio, enzimi chiamati ligasi sono utilizzati per unire frammenti di DNA insieme. Solo i frammenti di DNA che hanno estremità corrispondenti e complementari possono essere uniti mediante legatura.
Come funzionano le ligasi?
Le ligasi uniscono frammenti di DNA catalizzando la formazione di legami tra nucleotidi vicini.,
Legatura nelle cellule
Le cellule eseguono naturalmente la legatura durante la replicazione del DNA, quando i frammenti di Okazaki sono uniti tra loro. Le cellule usano anche la legatura per riparare il DNA che è stato danneggiato, sia dal normale metabolismo cellulare o da fattori ambientali, come la luce UV o le radiazioni. Fino a 1 milione di interruzioni possono verificarsi nel DNA di una singola cellula umana ogni giorno.,
Legatura in laboratorio
Affinché la legatura del DNA avvenga in laboratorio, la miscela di reazione deve contenere: frammenti di DNA complementari, un ligasebuffer e una fonte di energia. L’energia per questa reazione viene normalmente da una sostanza chimica chiamata ATP (adenosina trifosfato).
Ottenere i frammenti di DNA
Il DNA viene preparato per la legatura essendo tagliato in frammenti con enzimi di restrizione. Ogni enzima di restrizione taglia il DNA in un sito specifico e produce frammenti che hanno estremità “smussate” o “appiccicose”.,
Unire frammenti di DNA
Le ligasi possono unire qualsiasi frammento di DNA con estremità “smussate”. Possono anche unire frammenti di DNA con estremità “appiccicose”, ma solo se i nucleotidi sui fili sono complementari. Per ottenere complementari ‘estremità appiccicose’ i frammenti di DNA da unire devono essere tagliati con lo stesso enzima di restrizione.
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