7.19.2.1 Cloroformio (triclorometano)

Il cloroformio è usato come solvente industriale e come intermedio nella produzione di materiali polimerici. L’uso principale del cloroformio oggi è nella produzione del refrigerante R-22, comunemente usato nel settore del condizionamento dell’aria. Rapporti da diversi laboratori hanno dimostrato che la nefrotossicità acuta del cloroformio è dipendente da specie, ceppo e genere (Eschenbrenner e Miller 1945; Hill et al. 1975; Larson et al. 1993, 1994; Pohl et al., 1984; Smith et al. 1983, 1984; Torkelson et al. 1976), e che i topi maschi sono più sensibili di ratti, conigli o cani, mentre i topi femmine sono resistenti. Gonfiore tubulare, necrosi e calchi, localizzati principalmente nei tubuli prossimali, sono i principali cambiamenti istopatologici nel rene dopo l’esposizione di animali da esperimento al cloroformio. La nefrotossicità indotta da cloroformio è anche associata a concentrazioni elevate di azoto ureico nel sangue, proteinuria e glucosuria., L’assorbimento in vitro di anioni e cationi organici da parte di fette corticali renali è anche inibito dal trattamento in vivo con cloroformio (Kluwe e Hook 1978). Mentre l’esposizione umana al cloroformio è stata associata ad oliguria, proteinuria, aumento dell’azoto ureico nel sangue e necrosi tubulare renale, la dose soglia per la tossicità renale acuta del cloroformio nell’uomo non è nota. La localizzazione della lesione renale umana ai tubuli prossimali suggerisce un meccanismo comune di nefrotossicità del cloroformio nella maggior parte delle specie di mammiferi.,

Sono state descritte sia le vie ossidative che quelle riduttive del metabolismo del cloroformio, sebbene i dati in vivo siano limitati. L’anidride carbonica è il principale metabolita del cloroformio generato dalla via ossidativa del metabolismo in vivo. La via ossidativa genera anche metaboliti reattivi, incluso il fosgene (Pohl e Krishna 1978; Pohl et al. 1977), che è stato determinato in vitro con induzione fenobarbital (Testai e Vittozzi 1986; Tomasi et al. 1985; Wolf et al., 1977), mentre la via riduttiva genera il radicale libero del diclorometilcarbene (determinato in vitro ed in vivo, sia con che senza induzione del fenobarbital). Il metabolismo ossidativo e riduttivo procedono entrambi attraverso una fase di attivazione enzimatica dipendente dal citocromo P450 (CYP). L’equilibrio tra vie ossidative e riduttive dipende dalla specie, dal tessuto, dalla dose e dalla tensione dell’ossigeno (Ammann et al. 1998; Testai e Vittozzi 1986). Nei mammiferi intatti, la tensione ossidativa probabilmente preclude qualsiasi metabolismo significativo per via riduttiva (Mansuy et al. 1977; Pohl et al. 1977)., Il fosgene è prodotto dalla declorazione ossidativa del cloroformio in triclorometanolo, che spontaneamente deidroclorina. La deidroclorurazione del triclorometanolo produce una molecola di acido cloridrico e l’idrolisi del fosgene produce altre due molecole, in modo che tre molecole di acido cloridrico siano prodotte nella conversione del cloroformio in anidride carbonica (Pohl et al. 1980).

Il metabolita elettrofilo fosgene si lega covalentemente ai componenti nucleofili delle proteine tissutali (Uehleke e Werner 1975; Vittozzi et al. 1991)., Interagisce anche con altri nucleofili cellulari e si lega in una certa misura alle teste polari dei fosfolipidi (Brown et al. 1974; Fry et al. 1972). In alternativa, il fosgene reagisce con l’acqua per rilasciare anidride carbonica e acido cloridrico (Ahmed et al. 1977; Anders et al. 1978; Pohl et al. 1981). L’interazione del fosgene con il glutatione (GSH) porta alla formazione di S-clorocarbonil GSH, che può interagire con un GSH aggiuntivo per formare diglutationil ditiocarbonato o formare disolfuro di GSH e monossido di carbonio (Smith and Hook 1984)., L’incubazione di microsomi renali di topo con GSH aumenta la produzione di questi metaboliti dal cloroformio e diminuisce il legame irreversibile alle proteine e l’ulteriore metabolismo all’anidride carbonica (Vittozzi et al. 1991). GSH ridotto è in grado di pulire essenzialmente tutti i metaboliti del cloroformio prodotti in incubazioni con microsomi epatici di topo quando le concentrazioni di cloroformio non sono troppo alte. L’importanza relativa delle vie minori del metabolismo del fosgene dipende dalla disponibilità di GSH, altri tioli e altri composti nucleofili, come istidina e cisteina (Figura 1).,

Figura 1. Possibili vie del metabolismo del cloroformio nel rene.

il metabolismo Ossidativo, con CYP2E1 (etanolo-inducible monoossigenasi isoenzima sistema presente nel fegato dei mammiferi, compresi gli esseri umani) che giocano un ruolo chiave, è probabilmente l’unico significativo nel vivo del percorso di esposizioni basse, e i dati disponibili indicano che il metabolismo ossidativo ha un ruolo importante nella tossicità (Brady et al. 1989; Constan et al. 1999; Guengerich et al. 1991; Nakajima et al., 1995). Il ruolo dominante del CYP2E1 nel metabolizzare il cloroformio in metaboliti tossici è stato dimostrato in studi che coinvolgono il trattamento di animali con induttori enzimatici o inibitori, nonché studi su topi privi di CYP2E1 (Brady et al. 1989). Studi di immunoinibizione con proteina monoclonale anti-CYP2E1 hanno dimostrato che il CYP2E1 è responsabile dell ‘ 81% del metabolismo analizzato a bassa concentrazione di cloroformio (0,5 mmol l−1) nei microsomi epatici di ratti indotti da acetone (Ammann et al. 1998)., La tossicità per gli epatociti di ratto e topo incubati in vitro con cloroformio fino a 5 mmol l−1 è stata prevenuta dall’aggiunta di un inibitore del CYP2E1 o dalla ridotta tensione dell’ossigeno, sottolineando l’importanza del metabolismo ossidativo nella tossicità (Dicker et al. 1991; Ingelman-Sundberg et al. 1988; Johansson et al. 1990; Nakajima et al. 1995; Smith et al. 1979; Tsutsumi et al. 1989). La distribuzione regionale delle lesioni epatiche nei ratti e nei topi è ben correlata alla distribuzione epatica di CYP2E1 e GSH.,

CYP2B1 può anche avere un ruolo nel metabolismo del cloroformio, anche se questo è probabile che sia solo minore a basse concentrazioni di cloroformio tissutale (Nakajima et al. 1995). Tuttavia, ad alte concentrazioni tissutali (ad esempio, derivanti da una dose orale di 0,5 ml kg−1), l’epatotossicità del cloroformio è stata notevolmente potenziata nei ratti Wistar trattati con fenobarbital (un induttore del CYP2B1) ma non nei ratti trattati con n-esano (un induttore del CYP2E1), rispetto ai controlli non indotti (Lofberg e Tjalve 1986)., Uno studio in cui i ratti sono stati esposti al cloroformio ha mostrato che il metabolismo era più attivo nel fegato, seguito dal naso e dai reni. L ‘attività metabolica era correlata all’ accumulo di metaboliti.

Sebbene la bioattivazione del cloroformio ai metaboliti nefrotossici possa potenzialmente verificarsi nel fegato e nel rene, diversi studi hanno dimostrato che l’epatotossicità e la nefrotossicità indotte dal cloroformio possono essere modulate in modo diverso da vari trattamenti farmacologici, chimici o ormonali, suggerendo che il cloroformio è bioattivato da meccanismi indipendenti nel fegato e nel rene (Bailie et al., 1984). Il metabolismo renale del cloroformio da parte degli enzimi P450 si correla bene con la nefrotossicità indotta dal cloroformio (Ahmadizadeh et al. 1981; Pohl et al. 1984; Smith et al. 1983). È stata dimostrata la capacità del CYP2E1 umano di metabolizzare il cloroformio in vitro (Gonzalez e Gelboin 1994)., Pertanto, i risultati che il livello di questo enzima nel rene di topo maschio è significativamente più alto rispetto al rene di topo femminile e che il trattamento di topi femmina con testosterone, che potenzia la nefrotossicità del cloroformio nei topi femminili, aumenta significativamente questo enzima nel rene di topo femminile (Hu et al. 1993) suggeriscono un ruolo per il CYP2E1 renale nella nefrotossicità indotta da cloroformio. Resta da determinare l’entità dell’espressione del CYP2E1 nel rene umano e la sua regolazione da parte di vari fattori genetici, nutrizionali e ambientali., Gli enzimi CYP, diversi dal CYP2E1, possono anche metabolizzare il cloroformio. La disponibilità di diversi CYP umani espressi da cDNA dovrebbe consentire di identificare ulteriori isoforme CYP che potrebbero essere coinvolte nella bioattivazione del cloroformio. Questi studi possono aiutare a determinare quali specie animali potrebbero essere un modello adatto per valutare il rischio per l’uomo. Inoltre, poiché le macromolecole sono bersagli dell’alchilazione del fosgene, l’identificazione di bersagli critici può consentire una migliore comprensione di come la modificazione covalente delle macromolecole renali da parte del fosgene possa portare alla necrosi cellulare (Anand et al. 2006; Philip et al., 2006). Studi recenti hanno dimostrato che l’innesco subcronico del cloroformio protegge i topi da una dose letale successivamente somministrata di cloroformio. Gli autori hanno dimostrato che l’innesco iniziale stimolava la divisione cellulare renale e la riparazione dei tessuti. Questa riparazione renale è stata sostenuta anche dopo la somministrazione di una successiva dose letale di cloroformio.