Obiettivi di Apprendimento

  • Richiamo dideoxynucleotide sequenziamento

sequenziamento di Sanger, noto anche come catena di terminazione di sequenziamento, si riferisce a un metodo di sequenziamento del DNA sviluppato da Frederick Sanger nel 1977. Questo metodo si basa sull’amplificazione del frammento di DNA da sequenziare mediante DNA polimerasi e l’incorporazione di nucleotidi modificati – in particolare, dideossinucleotidi (ddNTPs).,

Il metodo classico di terminazione a catena richiede un modello di DNA a filamento singolo, un primer di DNA, una DNA polimerasi, desossinucleotidetrifosfati normali (DNTP) e nucleotidi modificati (dideoxyNTPs) che terminano l’allungamento del filamento di DNA. Questi nucleotidi terminanti a catena mancano di un gruppo 3 ‘ – OH richiesto per la formazione di un legame fosfodiestere tra due nucleotidi, causando la DNA polimerasi a cessare l’estensione del DNA quando viene incorporato un ddNTP. Il ddNTPs può essere radioattivamente o fluorescentemente etichettato per il rilevamento in macchine di sequenziamento automatizzate.,Il campione di DNA è diviso in quattro reazioni di sequenziamento separate, contenenti tutti e quattro i deossinucleotidi standard (dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e la DNA polimerasi. Ad ogni reazione viene aggiunto solo uno dei quattro dideossinucleotidi (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). A seguito di cicli di estensione del DNA del modello dal primer legato, i frammenti di DNA risultanti vengono denaturati a caldo e separati per dimensione utilizzando l’elettroforesi su gel. Questo viene spesso eseguito utilizzando un gel di poliacrilammide-urea denaturante con ciascuna delle quattro reazioni eseguite in una delle quattro corsie individuali (corsie A, T, G, C)., Le bande di DNA possono quindi essere visualizzate mediante autoradiografia o luce UV e la sequenza di DNA può essere letta direttamente dalla pellicola a raggi X o dall’immagine del gel.

Figura: Sequenziamento Sanger: Diversi tipi di sequenziamento Sanger, ognuno dei quali dipende dalla sequenza che viene interrotta da un dideossinucleotide terminante (barre nere).,

Le variazioni tecniche del sequenziamento della terminazione a catena includono l’etichettatura con nucleotidi contenenti fosforo radioattivo per la radiomarcatura o l’utilizzo di un primer etichettato all’estremità 5′ con un colorante fluorescente. Il sequenziamento del dye-primer facilita la lettura in un sistema ottico per analisi e automazione più veloci ed economiche. Lo sviluppo successivo da parte di Leroy Hood e colleghi di ddNTPs e primer fluorescenti etichettati ha posto le basi per il sequenziamento automatico del DNA ad alto rendimento. I metodi di terminazione a catena hanno notevolmente semplificato il sequenziamento del DNA., Più recentemente, è stato sviluppato il sequenziamento del colorante-terminatore. Il sequenziamento del Dye-terminator utilizza l’etichettatura del terminatore a catena ddNTPs, che consente il sequenziamento in una singola reazione, piuttosto che in quattro reazioni come nel metodo etichettato-primer. In dye-terminator sequenziamento, ciascuno dei quattro terminatori catena dideoxynucleotide è etichettato con coloranti fluorescenti, ognuno dei quali emettono luce a diverse lunghezze d’onda.,

Figura: Cromatografo: Questo è un esempio dell’output di un sequenziamento Sanger letto utilizzando terminatori di coloranti con etichetta fluorescente. Le quattro basi del DNA sono rappresentate da diversi colori che vengono interpretati dal software per dare la sequenza di DNA di cui sopra.

Gli strumenti automatici di sequenziamento del DNA (sequencer del DNA) possono sequenziare fino a 384 campioni di DNA in un singolo lotto (run) in un massimo di 24 esecuzioni al giorno., I sequencer del DNA eseguono l’elettroforesi capillare per la separazione delle dimensioni, il rilevamento e la registrazione della fluorescenza del colorante e l’uscita dei dati come cromatogrammi fluorescenti della traccia di picco. L’automazione ha portato al sequenziamento di interi genomi.

Punti chiave

  • La mancanza del secondo gruppo deossi su un dNTP rendendolo ddNTP, interrompe l’incorporazione di ulteriori nucleotidi, questa terminazione crea lunghezze di DNA fermate ad ogni nucleotide, questo è centrale per identificare ulteriormente ogni nucleotide.,
  • È possibile utilizzare diverse etichette, ddNTPS, dNTPs e primer possono essere etichettati con radioattività e fluorescenza.
  • Utilizzando etichette fluorescenti, il sequenziamento dideoxy può essere automatizzato consentendo metodi ad alto throughput che sono stati utilizzati per sequenziare interi genomi.

Termini chiave

  • cromatogramma: L’output visivo di un cromatografo. Di solito un display grafico o istogramma.
  • dideossinucleotide: qualsiasi nucleotide formato da un desossinucleotide per perdita di un secondo gruppo idrossi dal gruppo desossiribosio