SZÖVEG

Natalizumab, egy antitest kezelésére visszaeső sclerosis multiplex (SM), megakadályozza, hogy a kereskedelem az aktivált limfociták, beleértve autoreactive limfociták, át a vér-agy gáton (BBB). A natalizumab fő káros hatása a progresszív multifokális leukoencephalopathia (PML), amely egy pusztító demielinizáló betegség, amelyet a humán JC polyomavírus (JCV) replikációja okoz oligodendrocitákban és asztrocitákban (1, 2)., Natalizumab az effektor t-sejtkereskedelem gátlása a vérből a központi idegrendszerbe (CNS) elősegítheti a helyi JCV replikációt (3-7).

itt megvizsgáltuk a JCV-specifikus effektor memória T-sejtek (TEM) jelenlétét az MS-betegek vérében az éjszakai antigén aktiválás után ex vivo. In vivo a specifikus TEM-számok csökkennek, ha a rokon antigén kiürül (8-10), és jelenlétük így folyamatos JCV-replikációra utalhat. A TEM gyorsan felszabadítja a citokineket, például a gamma-interferont (IFN-γ), amikor antigénre újraexponálják., Egy korábbi enzimhez kötött immunszorbens spot vizsgálat (ELISPOT) a JCV peptidekkel való hosszú távú aktiválást követően legfeljebb 14 napig (11) vizsgálta az IFN-γ expressziót T-sejtekben. Az elhúzódó aktiválás azonban lehetővé teszi a hosszú távú nyugalmi t-sejtmemória újraaktiválását és kibővítését, ami azt jelenti, hogy a pozitív válasz nem feltétlenül jelenti a folyamatban lévő immunválaszt. Itt először megvizsgáltuk a JCV-specifikus TEM jelenlétét két SM-ben szenvedő betegben, akik PML-t fejlesztettek ki. Az első beteget 39 hónap elteltével diagnosztizálták PML-vel natalizumabbal (39 infúzió) (neurológiai osztály, Pitié-Salpétrière Kórház)., 39 éves volt, és 10 éves múltra tekint visszaeső-remittáló MS. a natalizumabot megelőzően ciklofoszfamidot és mitoxantront kapott. A PML-t MRI és JCV PCR igazolta a cerebrospinális folyadékon (CSF). A JCV-specifikus TEM vizsgálata során, 8 héttel a PML tünet megjelenése után, 1040 JCV Genom másolata volt ml CSF-enként(JCV Q-PCR Riasztókészlet; Nanogen Advanced Diagnostics). A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) in vitro aktiválták aim-V és Albumax közegben (Invitrogén) 16 órán keresztül tisztított JCV-vel (Mad-4 törzs; LGC Promochem; 104,5 50% szövetkultúra infektív dózis /0,2 ml)., Nem adtak hozzá rekombináns interleukin 2-t (IL-2). Mindegyik kúthoz 5534 PFU-nak megfelelő vírusmennyiséget adtak. Ez megfelelt a 0,02-es fertőzés (MOI) sokaságának. A sejteket ezután intracelluláris IFN-γ-ra tesztelték áramlási citometriával. Az éjszakai aktiválást követő sejtpusztulás kevesebb, mint 5% volt. Amint az ábrán látható. 1a és andB,B, reagáló sejteket detektáltak mind a CD4, mind a CD8 T-sejt alcsoportokban, és többségükben a ccr7− CD45RA− fenotípus jellemző a memória effektorokra (12)., Az anti-JCV TEM-et az IFN-γ ELISPOT (capture and detection antitestek, 1-D1 és K7-B6-1 klónok, illetve Mabtech) is detektálta 16 órás aktiválást követően tisztított JCV vagy VP – 1 peptidekkel (14 medence átfedő 15-amino-sav peptid keveréke, amely a teljes JCV VP-1 fehérjét lefedi) (ábra. 1C). A második beteg 46 éves volt, és 11 éves kórtörténetében relapszáló-remitáló MS.a natalizumabot megelőzően béta-interferont, glatiramer-acetátot, azatioprint és mitoxantront kapott. 24 natalizumab infúzió után a Tenon Hospital MS központba utalták átértékelésre., A 2012 májusában végzett agyi MRI egy kis, lineáris, T2-hiperintenzív gyanús elváltozást észlelt a juxtacortical jobb frontális régióban. Az első CSF minta negatív volt a JCV esetében. Az ismételt MRI a natalizumab-elvonás után a lézió méretének növekedését mutatta, ami két további CSF-vizsgálatot eredményezett, amelyek mindkettő negatív volt a JCV-re. A plazmában lévő JCV PCR-t 2 és 4 hónappal a PML megjelenése után végezték el. Mindkét plazma minta negatív volt. A 2012 szeptemberében elvégzett agybiopszia végül megerősítette a PML diagnózisát.,

JCV-specifikus effektor memória T-sejtek (TEM) kimutatása két natalizumabbal kezelt, PML-ben szenvedő beteg vérében. Az A és B panelben egy olyan beteg PBMC-jét aktiválták, akiknél a natalizumab-kezelést követően PML alakult ki (39 infúzió) egy éjszakán át tisztított JC vírussal, majd intracelluláris IFN-γ-t teszteltek áramlási citometriával a CD4 és CD8 T-sejtes alcsoportokban (A és B). Az IFN-γ-pozitív és-negatív sejteken ccr7 és CD45RA expresszió is látható a CD4 T sejtek (A) és a CD8 T sejtek (B) esetében., A C panelen a natalizumabbal kezelt 2 beteg PBMC-je (az 1.és a 2. beteg 39, illetve 24 infúziót kapott) egy éjszakán át aktiválódott tisztított JC vírussal és/vagy egy VP1 peptidkészlettel az IFN-γ elispot előtt. Az IFN-γ foltok száma 0,25 × 106 PBMC-enként az egynapos aktiválás után tisztított JCV és JCV peptidkészletekkel 54, illetve 21 volt (kezeletlen kút, 0 folt) az 1.betegben. A 2. betegben a tisztított JCV 15 foltot eredményezett (kezeletlen kút, 0 folt).,

a JCV-re adott IFN-γ válasz ELISPOT analízise, amelyet az utolsó natalizumab infúzió után 2 nappal végeztek, JCV-specifikus TEM jelenlétét mutatta a vérben (2.ábra). 1C). Érdekes módon a keringő JCV-specifikus TEM-számok alacsonyabbak voltak, mint az első PML-es beteg esetében, akiknél magasabb volt a JCV-replikáció szintje az agyban, mivel a CSF-en a JCV PCR pozitív volt az első betegnél, a második pedig negatív.,

azt is megvizsgáltuk, hogy a jelenléte JCV-specifikus TEM által ELISPOT egy sor 62 SM betegek relapszáló-remittáló SM-val kezelt natalizumab szerint az Európai gazdasági feltételek, valamint a 35 SM betegek, akik nem kapnak semmilyen betegség-módosító kezelés, illetve egy csoport 40 egészséges donorok illeszkedik a kora, neme, a SM-es betegekben. Az MS-betegek jellemzői az 1. táblázatban találhatók. A betegek és az egészséges donorok írásban hozzájárultak a vizsgálatban való részvételhez, amelyet a párizsi Pitié-Salpêtrière kórház etikai bizottsága hagyott jóvá., Az ELISPOT válasz pozitívnak tekinthető, ha a korrigált foltok száma (az aktivált kutakban lévő foltok száma mínusz a kezeletlen kutakban lévő foltok száma) legalább 10 volt, kevesebb mint 10 folt a kezeletlen kutakban.

a pozitív minták aránya 2,5% volt egészséges donoroknál (1.ábra). 2A). Az MS-csoportban a pozitív betegek százalékos aránya a natalizumab-kezelés idejével emelkedett (ábra. 2B andC),C), a 8,8% – kal, a kezeletlen SM betegek 15.9% között natalizumabbal kezelt betegek kevesebb, mint 24 hónap, 27% a kezelt betegek körében több mint 24 hónap (Fig., 2C) (szignifikáns a 24 hónapnál hosszabb ideig kezelt betegeknél, szemben a kezeletlen SM-vel és a kontroll alanyokkal). A JCV TEM válaszok kimutatási gyakoriságának ez a növekedése arra utalt, hogy a hosszan tartó natalizumab-kezelés kedvezett a JCV reaktiválódásának.

a JCV-specifikus TEM fokozott kimutatása natalizumab-kezelésben részesülő betegeknél. Panelek, illetve A B képviseli a száma, IFN-γ foltok per 0.25 × 106 PBMC után egyik napról a másikra az aktiválás tisztított JC vírus 40 egészséges donorok (a), illetve a 99 MS betegek szerint a natalizumab (B)., A B panelen a 2 PML-es beteget egy zárt háromszög és egy zárt négyzet jelöli. A szaggatott vonal a pozitivitási kivágást jelenti (lásd a szöveget). A C Panel a JCV-ELISPOT-pozitív minták százalékos arányát képviseli egészséges donorokban (HD), kontroll betegekben (kezeletlen MS) és natalizumabbal kezelt betegeknél, legfeljebb 2 évig (0-24 hónap) vagy tovább (24-48 hónap). Néhány natalizumabbal kezelt beteget 2 vagy 3 alkalommal vizsgáltak. Az elemzett vérminták számát az alábbiakban mutatjuk be. A statisztikai elemzés Fisher tesztjét használta., A D Panel JCV ELISPOT eredményeket mutat azoknál a betegeknél, akiket 2 vagy 3 alkalommal teszteltek. Az E Panel a vizelettel JCV PCR és JCV ELISPOT eredményeit mutatja be 50, natalizumabbal kezelt betegen és 14 egészséges donoron, akiket mindkét vizsgálattal vizsgáltak. Az F Panel a JCV szerológia és a JCV ELISPOT eredményeit mutatja be 56 MS-os natalizumab-kezelésben részesülő betegen, akiket mindkét vizsgálatban teszteltek.

a natalizumabbal kezelt betegek egy részéből legalább kétszer mintát vettek (lásd 1.táblázat). Amint az ábrán látható. 2D, a legtöbb ilyen beteg vagy pozitív lett vagy maradt a mintavételi időszak alatt.,

a vese a JCV egyik fő tartálya. Az általános populáció jelentős százaléka a vírust a vizeletében üríti ki, de nincs bizonyíték arra, hogy a vérében JCV van (13-15). Ezenkívül a JCV DNS jelenléte az agyban függetlennek tűnik a vesében való jelenlététől (16). Amint az ábrán látható. 2E, a vérben kimutatható JCV TEM-ben szenvedő SM betegek 60% – ánál nem volt kimutatható JCV a vizeletükben, és a vizeletben pozitív JCV PCR-ben szenvedő betegek 69% – ánál nem volt kimutatható JCV TEM. JCV vizeletürítés kimutatható JCV TEM nélkül egészséges donoroknál is megfigyelhető volt (Fig. E.2., Ez arra utal, hogy a JCV replikáció jelenléte a vesében nem feltétlenül vezet kimutatható JCV TEM-hez a vérben. Ezzel szemben ez felveti annak lehetőségét, hogy a JCV TEM kimutatása a vérben tükrözheti a folyamatban lévő extrarenális JCV replikációt.

egy új JCV enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálati módszerrel (ELISA) végzett vizsgálatban (17) a JCV becsült szeroprevalenciája a natalizumabbal kezelt SM betegeknél 53,6% volt (17). A szeropozitivitás nem feltétlenül korrelál a TEM-válaszok jelenlétével, amely a vírus újraaktiválódásához kapcsolódik., A hosszú élettartamú plazmasejtek hosszú ideig, talán évtizedekig fennmaradhatnak a csontvelőben, fenntartva a szérum antitest titereket aktív kórokozó replikáció nélkül (18, 19). Ugyanazt az ELISA módszert alkalmaztuk a natalizumabbal kezelt SM betegek 56 tesztelésére, akiket JCV ELISPOT tesztelt, beleértve a 2 PML-es betegeket is. Amint az ábrán látható. 2F, a betegek 53,6% – a szeropozitív és 16,1% – a ELISPOT pozitív volt. A JCV-szeropozitív betegek huszonhét százalékában kimutatható JCV TEM volt a vérükben. Csak egy, JCV ELISPOT pozitív beteg volt szeronegatív., Gorelik et al., a JCV szerológiai vizsgálat hamis negatív aránya 2,5% (17).

eredményeink azt mutatják,hogy a JCV TEM válaszok kimutatásának gyakorisága MS-s betegeknél növekszik a natalizumab-kezelés idejével. Egy korábbi vizsgálat azt is kimutatta, hogy a T-sejt válaszai 12 hónapos natalizumab-kezelés után növekedtek a JCV-re, de ez a vizsgálat 18 hónapos kezelésre korlátozódott (20), míg azt találtuk, hogy az effektor T-sejt válaszainak legerősebb növekedése 24 hónap után történt.,

eredményeink tehát a natalizumab-kezelés alatt a JCV reaktivációra utalnak, beleértve az extrarenális helyeket is. JCV-t észleltek a HIV-szeronegatív egyének agyában PML nélkül (21). A natalizumab által kiváltott csökkent központi idegrendszeri immunosurveillance elősegítheti a helyi vírus újraaktiválódását, amely tünetmentes intermittáló vírusreplikációként kezdődhet, de a tartós vírusreplikáció felé, majd a PML-hez fejlődhet. A vírus újraaktiválása a perifériás specifikus T-limfocitákat antigénbemutató sejteken keresztül aktiválhatja olyan helyeken, mint például az agyelszívó nyaki nyirokcsomók (22-24)., Mivel a natalizumab a VLA-4 receptort célozza meg, ezek a specifikus sejtek nem képesek hatékonyan átjutni a vér-agy gáton, így felhalmozódhatnak a vérben, megkönnyítve azok kimutatását. A PML a késői stádiumú HIV-fertőzés szövődménye is. Az, hogy a JCV-specifikus effektor CD4 és CD8 T sejtek kimutatása megelőzheti-e az AIDS-hez társuló PML-t, további vizsgálatot érdemel. Az AIDS-hez társuló PML azonban egyértelműen különbözik a natalizumab által kiváltott PML-től., A legtöbb HIV-fertőzött betegek, akiknél PML mély CD4 lymphopenia, amely szintén megváltoztatja CD8 T-sejt funkcionalitás hiánya révén CD4 segítség (25). Továbbá, ellentétben a betegek a natalizumab, nincs blokád T-sejt-kereskedelem át a vér-agy gáton, ez megakadályozhatja JCV-specifikus TEM felhalmozódása a vérben.

eredményeink együttesen azt sugallják, hogy a JCV-specifikus TEM válaszok kimutatására alkalmas funkcionális vizsgálatok segíthetnek azonosítani azokat a betegeket, akiknél fennáll a PML kialakulásának kockázata olyan antitestekkel történő kezelés során, amelyek gátolják a limfocita kereskedelmet a vér-agy gáton keresztül.,