kezdő útmutató a következő generációs szekvenáláshoz (NGS) technológia

az emberi genom projekt befejezése 2003—ban a gyors, megfizethető és pontos genomelemzés új korszakában-az úgynevezett következő generációs szekvenálás (NGS) – ben. Az NGS az “első generációs szekvenálási” technológiákra épít a pontos és költséghatékony szekvenálási eredmények elérése érdekében.

Fred Sanger szekvenálta az első teljes DNS-genomot, a vírusfágot ?1977-ben X174., Ugyanebben az évben Sanger kifejlesztette a genom korszakának jövőbeli gerincét: a DNS szekvenálási technológiát. Technikája a láncvégződési módszert alkalmazta. Ezt most a genomszekvenálás “első generációs technológiájának” tekintik.

mivel a Sanger szekvenálás (vagy a láncvégződési módszer) a szekvenálási technológia első generációja, ennek megértése nagyon fontos. Az emberi genom projekt Sanger szekvenálási technológiával kezdődött.,

A Sanger szekvenálási módszer

a Sanger szekvenálási módszer a didoxinukleotidokra (ddNTPs),a dezoxinukleozid-trifoszfátok (dNTPs) egyik típusára támaszkodik, amelynek nincs 3′ hidroxilcsoportja, és helyette hidrogénatom van . Amikor ezek a bázisok kötődnek a növekvő DNS-szekvenciához, megszüntetik a replikációt, mivel nem köthetnek más bázisokat. A Sanger szekvenálás végrehajtásához hozzáadja az alapozókat egy olyan megoldáshoz, amely tartalmazza a szekvenálandó genetikai információkat, majd ossza fel az oldatot négy PCR reakcióra., Minden reakció a-t tartalmaz dNTP-keverékkel, a négy nukleotid egyike ddNTP-vel helyettesítve (a, T, G és C ddNTP csoportok). A PCR végén mind a négy reakció különböző hosszúságú PCR termékeket eredményez, mivel a replikáció véletlenszerűen megszűnik. Ha a mintákat 4 sávos gélen futtatja, akkor összerakhatja a sorrendet, mivel az egyes sorozatokat ugyanabból az eredeti anyagból replikálták. Itt van egy példa, ahol a ddntps félkövér, a dNTPs pedig nem:

a szekvencia ATGCTCAG.,

a négy reakció ad:
reakció ddatp: a, ATGCTCA, ATGCTCAG
reakció ddgtp: ATG, ATGCTCAG
reakció ddctp: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
reakció ddttp: AT, ATGCTCT, ATGCTCAG

minden reakció, ha fut egy gél nézne ki valami ilyesmi (kép by Olwen Reina):

minden sáv a különböző hosszúságú kódot jelöli. Például, a zenekar a jobb az ” A ” szimbolizálja a szekvencia:”ATGCTCA”

még mindig zavaros?

képzeljünk el egy társasjátékot. A játék egy találgatás játék., Itt van, hogyan kell játszani:

egy számra gondolsz, és a csoportnak kitalálnia kell. A trükkös rész az, hogy a szám 200 számjegyű. A szám számjegyeit a fejedben olvassa anélkül, hogy hangot adna. Minden olyan gyakran, amikor valaki félbeszakít, és azt mondja nekik, hogy az egyetlen számjegy, amire gondoltál, és hogy hol van a 200-as sorrendben. Minden alkalommal, amikor megszakad, újra kell kezdenie. Néhány óra múlva indulsz, és a csoportnak ki kell találnia a 200 jegyű számot., Össze kell gyűjteniük az Ön által megadott információkat, például a 25. szám 5 volt, a 40.szám 0 volt, stb. A megszakításokból származó információk felhasználásával megismételhetik az általuk megadott számot.

bár ez a világ legbénább játékának hangzik, nagyon jól működik a szekvenáláshoz!

sajnos lassú, drága, és (korábban) radioaktív anyagokra támaszkodik. Ez arra késztette a tudósokat, hogy fejlesszék ki a genomszekvenálás új és jobb formáit.,

következő generációs szekvenálási technológiák

a genomszekvenálás legnagyobb előrelépése a sebesség és a pontosság növelése volt, ami a munkaerő és a költségek csökkenését eredményezte. A sebesség a párhuzamos elemzésnek és a nagy áteresztőképességű technológiának köszönhető. Ez a különbség abban, hogy egy 4 éves gyerek elolvassa Moby Dick-et, és egy-egy paragrafust ad egy csomó drámaírónak, és arra kéri őket, hogy azonnal olvassanak.

A szekvenáló gépek vadul javultak, mióta Sanger kifejlesztette módszerét., 1987-ben az Applied Biosystems lett az első, aki bevezette az AB370 nevű automatikus szekvenáló gépet. A gép egy kapilláris elektroforézisnek nevezett módszerre támaszkodott, amely Sanger láncvégződési módszerét gél nélkül alkalmazta.

fluoreszcens címkével ellátott láncvégző ddNTPs-t adunk a PCR reakciókeverékhez. A Sanger szekvenálási módszerrel különböző hosszúságú PCR-termékeket hoznak létre, majd méretük szerint elválasztják őket. A méretet a PCR termék általános negatív töltésével mérik. Minél negatívabb a töltés, annál hosszabb a töredék., Vegyük a fenti példát a ddNTP beépítésére, és képzeljük el, hogy a félkövér betűk ddNTP-k, fluorokrómmal rögzítve. Mivel a fragmenseket egy kapilláris pozitív elektróda felé húzzák (lásd az alábbi képet), egy lézersugarat adnak át, amely a ddNTP-hez csatlakoztatott fluorokróm fény villanását váltja ki, amely az alaptípusra jellemző (például zöld A, sárga T, Kék g, piros C). Ily módon a genomot gondosan olvassa el.

a legnagyobb különbség itt a sebesség és a költség volt., Az AB370 egyszerre 96 bázist, napi 500k bázist tudott észlelni, és párhuzamos analízis és nagy áteresztőképességű beállítás segítségével 600 bázissal rendelkezett. A szekvenálás ezen formája lett az emberi genomprojekt befejezésének fő eszköze.

hogyan viszonyul az NGS az első generációs szekvenáláshoz?

az NGS-t a jobb pontosság és sebesség jellemzi, de csökkenti a munkaerőt és a költségeket is. Soha nem volt olyan idő, amikor olyan olcsó, kényelmes vagy egyszerű volt a genom szekvenciája., Vitathatatlanul a legnagyobb javulás a párhuzamos elemzés fejlesztése volt, amely növelte a szekvenálási sebességet.

az egyetlen dolog, ami most lelassít minket, az eredmények értelmezése!