tanulási célok

  • visszahívás dideoxinukleotid szekvenálás

Sanger szekvenálás, más néven láncszekvenálás, a DNS szekvenálás befejezésének módszerére utal Frederick Sanger fejlesztette ki 1977-ben. Ez a módszer a DNS – polimerázzal szekvenálandó DNS-fragmentum amplifikációján és módosított nukleotidok-konkrétan a didoxinukleotidok (ddNTPs) beépítésén alapul.,

a klasszikus láncvégződési módszer egyszálú DNS-sablont, DNS-alapozót, DNS-polimerázt, normál dezoxinukleotidetrifoszfátokat (dNTPs) és módosított nukleotidokat (dideoxyNTPs) igényel, amelyek megszüntetik a DNS-szál megnyúlását. Ezek a láncvégződésű nukleotidok nem rendelkeznek olyan 3 ‘ – OH csoporttal, amely két nukleotid közötti foszfodiészter kötés kialakulásához szükséges, így a DNS-polimeráz megszűnik a DNS kiterjesztésében, amikor ddNTP-t építenek be. A ddNTP-k radioaktívan vagy fluoreszcens címkével rendelkezhetnek az automatizált szekvenáló gépekben történő kimutatáshoz.,A DNS-mintát négy különálló szekvenálási reakcióra osztják, amelyek mind a négy standard dezoxinukleotidot (dATP, dGTP, dCTP és dTTP) és a DNS-polimerázt tartalmazzák. Minden reakcióhoz csak a négy didoxinukleotid (ddATP, ddGTP, ddCTP vagy ddTTP) egyikét adjuk hozzá. A kötött primer DNS-kiterjesztésének menetét követően a kapott DNS-fragmenseket hő denaturáljuk, majd gél-elektroforézissel méret szerint elválasztjuk. Ezt gyakran denaturáló poliakrilamid-karbamid gél alkalmazásával hajtják végre, a négy reakció mindegyikével négy különálló sáv egyikében (a, T, G, C sáv)., A DNS-sávokat ezután autoradiográfiával vagy UV-fénnyel lehet megjeleníteni, a DNS-szekvencia pedig közvetlenül leolvasható a röntgenfilmről vagy a gélképről.

ábra: Sanger szekvenálás: a Sanger szekvenálás különböző típusai, amelyek mindegyike attól függ, hogy a szekvenciát a dideoxinukleotid (fekete sávok) leállítja-e.,

a láncvégződések szekvenálásának technikai variációi közé tartozik a radioaktív foszfort tartalmazó nukleotidokkal való címkézés radioaktív jelöléshez, vagy az 5′ végén fluoreszkáló festékkel jelölt primer használata. A festék-primer szekvenálás megkönnyíti az optikai rendszerben történő olvasást a gyorsabb és gazdaságosabb elemzés és automatizálás érdekében. A későbbi fejlesztés Leroy Hood és munkatársai fluoreszcens címkével ellátott ddntps és primers beállította a terepet az automatizált, nagy áteresztőképességű DNS szekvenáláshoz. A láncvégződési módszerek jelentősen leegyszerűsítették a DNS-szekvenálást., Újabban a festék-Terminátor szekvenálást fejlesztették ki. A festék-Terminátor szekvenálás a lánc Terminátor ddntps címkézését használja, amely lehetővé teszi a szekvenálást egyetlen reakcióban, nem pedig négy reakciót, mint a címkézett primer módszernél. A festék-Terminátor szekvenálásban a négy didoxinukleotid lánc Terminátor mindegyikét fluoreszkáló festékekkel jelölik, amelyek mindegyike különböző hullámhosszon bocsát ki fényt.,

Ábra: Kromatográf: Ez egy példa a kimenet egy Sanger szekvenálás olvasni fluorescently címkézett festék-terminátorok. A négy DNS-bázist különböző színek képviselik, amelyeket a szoftver úgy értelmez, hogy megadja a fenti DNS-szekvenciát.

az automatizált DNS-szekvenáló eszközök (DNS-szekvenálók) akár 384 DNS-mintát is szekvenciálhatnak egyetlen tételben (Futtatás) naponta legfeljebb 24 alkalommal., A DNS-szekvenálók kapilláris elektroforézist végeznek a festékfluoreszcencia méretének szétválasztására, kimutatására és rögzítésére, valamint fluoreszcens csúcskromatogramként történő adatkibocsátásra. Az automatizálás a teljes genomok szekvenálásához vezetett.

főbb Pontok

  • a hiánya A második deoxy csoport egy dNTP, hogy ddNTP, megáll a beépítése további nukleotidok, ez a felmondás teremt DNS hossza megállt minden nukleotid, ez a központi eleme, hogy további azonosító egyes nukleotid.,
  • különböző címkék használhatók, a ddntps, a dNTPs és a primers mind radioaktivitással és fluoreszcens módon címkézhető.
  • fluoreszkáló címkék használatával a dideoxi szekvenálás automatizálható, lehetővé téve a nagy áteresztőképességű módszereket, amelyeket teljes genomok szekvenciálására használtak.

Kulcsfeltételek

  • kromatogram: a kromatográf vizuális kimenete. Általában grafikus kijelző vagy hisztogram.
  • dideoxinukleotid: bármely nukleotid, amely dezoxinukleotidból képződik a dezoxiribóz csoportból származó a második hidroxi-csoport elvesztése miatt