Začátečník je Průvodce, aby Příští Generace Sekvenování (NGS) Technologie

dokončení Projektu Lidského Genomu v roce 2003 ohlašoval nové éry rychlého, cenově dostupné a přesné analýzy genomu—tzv. Next Generation Sequencing (NGS). NGS staví na technologiích „sekvenování první generace“, aby poskytly přesné a nákladově efektivní výsledky sekvenování.

Fred Sanger sekvenoval první celý genom DNA, virový fág ?X174, v roce 1977., Ve stejném roce vyvinul Sanger budoucí páteř genomové éry: technologii sekvenování DNA. Jeho technika používala metodu ukončení řetězce. To je nyní považováno za „technologii první generace“ sekvenování genomu.

vzhledem k tomu, že Sanger sekvenování (nebo metoda ukončení řetězce) je první generací technologie sekvenování, pochopení je velmi důležité. Projekt lidského genomu začal technologií sekvenování Sanger.,

Sanger Metoda Sekvenování

Sanger metoda sekvenování spoléhá na dideoxynucleotides (ddNTPs),typ deoxynucleoside trifosfáty (dntp), které postrádají 3′ hydroxylové skupiny a atomu vodíku místo . Když se tyto báze vážou na rostoucí sekvenci DNA, ukončí replikaci, protože nemohou vázat jiné báze. Provádět Sanger Sekvenování, můžete přidat svůj primery k řešení obsahující genetické informace, které mají být sekvenovány, pak rozdělit řešení do čtyř PCR reakce., Každá reakce obsahuje směs s dNTP s jedním ze čtyř nukleotidů substituovaných skupinou ddNTP (a, T, G A C ddntp). Na konci PCR, každá z vašich čtyř reakcí přinese PCR produkty různých délek, protože replikace je náhodně ukončena. Spuštěním vzorků na gel se 4 pruhy, můžete poskládat sekvenci jako každá sekvence byla replikována ze stejného původního materiálu. Zde je příklad, kde jsou ddntps tučně a dNTPs nejsou:

vaše sekvence je ATGCTCAG.,

Své čtyři reakce vám:
Reakce s ddATP:, ATGCTCA, ATGCTCAG
Reakce s ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reakce s ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reakce s ddTTP: NA, ATGCT, ATGCTCAG

Všechny reakce jednou spustit gel bude vypadat nějak takhle (Obrázek tím, že Olwena Reina):

Každá kapela označuje různé délky kód. Například kapela je vpravo pod „A“ symbolizuje sekvenci:“ATGCTCA“

stále zmatená?

představme si párty hru. Hra je hádání hra., Zde je návod, jak se hraje:

uvažujete o čísle a skupina to musí uhodnout. Ošemetná část je, že číslo má délku 200 číslic. Čtete číslice čísla v hlavě bez zvuku. Každý člověk vás tak často přeruší a vy jim řeknete jedinou číslici, na kterou jste právě mysleli a kde je v pořadí 200. Pokaždé, když jste přerušeni, musíte začít znovu. Odejdete po několika hodinách a skupina musí přijít na 200místné číslo., Mají se dát dohromady informace, které jste jim dal, například 25 číslo 5, 40 počet byl 0, a tak dále. Pomocí informací z jejich přerušení mohou opakovat číslo, které vám dali.

i když to zní jako nejkrutější hra na světě, funguje to velmi dobře pro sekvenování!

bohužel je pomalý, drahý a (dříve) se spoléhá na radioaktivní materiály. To přimělo vědce k vývoji nových a lepších forem sekvenování genomu.,

technologie sekvenování nové generace

největším pokrokem v sekvenování genomu bylo zvýšení rychlosti a přesnosti, což vedlo ke snížení pracovní síly a nákladů. Rychlost je díky paralelní analýze a technologii s vysokou propustností. Je to rozdíl mezi dostat 4 letý číst Moby Dick a dávat odstavec každý na spoustu dramatických majorů a žádá je, aby číst najednou.

sekvenční stroje se od doby, kdy Sanger vyvinul svou metodu, velmi zlepšily., V roce 1987 se Applied Biosystems stal prvním, kdo představil automatický sekvenční stroj nazvaný AB370. Stroj se spoléhal na metodu zvanou kapilární elektroforéza, která používala sangerovu metodu ukončování řetězce bez nutnosti gelu.

do reakční směsi PCR se přidávají fluorescenčně značené ddNTPs s ukončujícím řetězcem. Metodou sekvenování Sanger se vytvářejí produkty PCR různých délek a poté se oddělují podle jejich velikosti. Velikost se měří celkovým záporným nábojem produktu PCR. Čím zápornější je náboj, tím delší je fragment., Vezměte výše uvedený příklad začlenění ddntp a představte si, že tučná písmena jsou ddntps s připojeným fluorochromem. Jako fragmenty jsou taženy směrem ke kladné elektrody, kapilární (viz obrázek níže), se projít laserový paprsek, který spouští záblesk světla z fluorochrome připojen k ddNTP, který je charakteristický pro základní typ (například, zelená A, žlutá pro T, modrá G, červená C). Tímto způsobem je genom pečlivě přečten.

největším rozdílem zde byla rychlost a cena., AB370 mohl detekovat 96 bází najednou, 500K bází denně a měl délku čtení 600 bází pomocí paralelní analýzy a nastavení vysoké propustnosti. Tato forma sekvenování se stala hlavním nástrojem pro dokončení projektu lidského genomu.

jak NGS porovnává sekvenování první generace?

NGS se vyznačuje zlepšenou přesností a rychlostí, ale také sníženou pracovní silou a náklady. Nikdy nebyla doba, kdy by bylo tak levné, pohodlné nebo jednoduché sekvenci genomu., Pravděpodobně největším zlepšením byl vývoj paralelní analýzy, která zvýšila rychlost sekvenování.

jediná věc, která nás nyní zpomaluje, je interpretace výsledků!