PMC (Čeština)

TEXT

Natalizumab, protilátka se používá k léčbě relabující roztroušené sklerózy (MS), zabraňuje obchodování s lidmi z aktivovaných lymfocytů, včetně autoreactive lymfocytů přes hematoencefalickou bariéru (BBB). Hlavní nežádoucí účinek natalizumabu je progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML), zničující demyelinizační onemocnění způsobené replikace lidského polyomaviru JC (JCV) v oligodendrocyty a astrocyty (1, 2)., Inhibice efektorových T-buněk z krve do centrálního nervového systému (CNS) může podpořit lokální replikaci JCV (3-7).

zde jsme zkoumali přítomnost T buněk specifické pro JCV efektorovou paměť (TEM) v krvi pacientů s MS po noční aktivaci antigenu ex vivo. In vivo, specifická čísla TEM klesají, jakmile je příbuzný antigen vyčištěn (8-10), a jejich přítomnost tak může poukazovat na pokračující replikaci JCV. TEM rychle uvolňuje cytokiny, jako je interferon gama (IFN-γ), když je reexponován na antigen., Předchozí enzyme-linked immunosorbent spot assay (ELISPOT) zkoumal IFN-γ výraz v T-buňky po dlouhodobé aktivace s JCV peptidy až po dobu 14 dnů (11). Dlouhodobá aktivace však umožňuje reaktivaci a rozšíření dlouhodobé klidové paměti T-buněk, což znamená, že pozitivní odpověď nemusí nutně znamenat pokračující imunitní odpověď. Zde jsme nejprve zkoumali přítomnost TEM specifického pro JCV u dvou MS pacientů, u kterých se vyvinul PML. První pacient byl diagnostikován PML po 39 měsících na natalizumabu (39 infuzí) (Neurologické oddělení, nemocnice Pitié-Salpétrière)., Bylo jí 39 let a měla 10letou historii recidivující-remitující MS.před natalizumabem dostala cyklofosfamid a mitoxantron. PML byla potvrzena MRI a JCV PCR na mozkomíšním moku (CSF). Při testování JCV specifických TEM, 8 týdnů po PML příznakem nástupu, měla 1,040 JCV kopií genomu / ml CSF (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). Její mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) byly aktivovány in vitro v cíli-V a Albumax medium (Invitrogen) po dobu 16 h s čištěná JCV (kmen MAD-4; LGC Promochem; 104.5 50% infekční dávka tkáňové kultury /0,2 ml)., Nebyl přidán žádný rekombinantní interleukin 2 (IL-2). Do každé jamky bylo přidáno množství viru odpovídající 5 534 PFU. To odpovídalo množství infekce (MOI) 0,02. Buňky byly poté testovány na intracelulární IFN-γ průtokovou cytometrií. Úmrtnost buněk po aktivaci přes noc byla nižší než 5%. Jak je znázorněno na obr. 1A a ab,B, reagovat buňky byly detekovány v obou CD4 a CD8 T-buňky, podskupiny, a většina z nich měla CCR7− CD45RA− fenotyp charakteristický paměti efektory (12)., Anti-JCV TEM byly také detekovány pomocí IFN-γ ELISPOT (zachycení a detekce protilátek, klony 1-D1 a K7-B6-1, respektive; Mabtech) po 16 h aktivace čištěným JCV nebo VP-1 peptidy (mix 14 bazény překrývajících 15-amino-kyseliny, peptidy pokrývající celý JCV VP-1 proteinů ) (Obr. 1C). Druhý pacient byl 46 let a 11-leté historii relaps-remitující formy roztroušené sklerózy. Před natalizumab, se jí dostalo interferon beta, glatiramer acetát, azathioprin, mitoxantron. Po 24 infuzích natalizumabu byla odkázána na centrum MS Tenon Hospital pro přehodnocení., MRI mozku provedená v květnu 2012 detekovala malou, lineární, T2-hyperintenzivní podezřelou lézi v juxtakortické pravé čelní oblasti. První vzorek CSF byl pro JCV negativní. Opakovaná MRI po vysazení natalizumabu odhalila zvýšení velikosti léze, což vedlo ke dvěma dalším vyšetřením CSF, z nichž obě byly negativní pro JCV. JCV PCR na plazmě byla provedena 2 a 4 měsíce po nástupu PML. Oba vzorky plazmy byly negativní. Mozková biopsie provedená v září 2012 konečně potvrdila diagnózu PML.,

ELISPOT analýza IFN-γ reakci na JCV, provádí se 2 dny po poslední infuzi natalizumabu, ukázala, že přítomnost JCV specifických TEM v krvi (Obr. 1C). Zajímavé je, že cirkulující JCV specifických TEM čísla byla nižší než v první PML pacienta, který může mít vyšší úroveň replikace JCV v mozku, jako JCV PCR na CSF byl pozitivní v první pacient, a negativní v druhé.,

také Jsme zkoumali přítomnost JCV specifických TEM pomocí ELISPOT v sérii 62 MS u pacientů s relaps-remitentní formou RS léčených natalizumabem podle Evropského marketingového hlediska, stejně jako v 35 MS u pacientů, kteří se nepřijímá žádnou chorobu modifikující terapii, a skupinou 40 zdravých dárců uzavřeno pro věk a pohlaví pacientů s MS. Charakteristiky pacientů s RS jsou uvedeny v tabulce 1. Pacienti a zdraví dárci dali svůj písemný souhlas k účasti na studii, kterou schválila Etická komise Nemocnice Pitié-Salpêtrière v Paříži., Odpověď ELISPOT byla považována za pozitivní, pokud opravený počet skvrn (počet skvrn v aktivovaných jamkách minus počet skvrn v neošetřených jamkách) byl nejméně 10, s méně než 10 skvrnami v neošetřených studních.

podíl pozitivních vzorků byl 2, 5% u zdravých dárců (obr. 2A). Ve skupině MS se procento pozitivních pacientů zvýšilo s časem na natalizumabu(obr. 2B a ac),C), z 8,8% u neléčených pacientů s RS, kteří na 15,9% u pacientů léčených natalizumabem po dobu kratší než 24 měsíců a 27% u pacientů léčených déle než 24 měsíců (Obr., 2C) (významné u pacientů léčených po dobu delší než 24 měsíců oproti neléčeným MS a Versus kontrolním subjektům ). Toto zvýšení frekvence detekce odpovědí JCV TEM naznačovalo, že prodloužená léčba natalizumabem zvýhodňovala reaktivaci JCV.

podskupina pacientů léčených natalizumabem byla odebrána nejméně dvakrát (viz tabulka 1). Jak je znázorněno na obr. 2D, většina těchto pacientů se během období odběru vzorků buď stala nebo zůstala pozitivní.,

ledvina je hlavní rezervoár pro JCV. Významné procento obecné populace vylučuje virus v moči, ale nemá žádné důkazy o JCV v krvi (13-15). Kromě toho se zdá, že přítomnost JCV DNA v mozku je nezávislá na její přítomnosti v ledvinách (16). Jak je znázorněno na obr. 2E, 60% pacientů s RS s detekovatelným JCV TEM v krvi nemělo v moči detekovatelný JCV a 69% pacientů s pozitivním JCV PCR v moči nemělo detekovatelný JCV TEM. Vylučování JCV močí bez detekovatelného JCV TEM bylo také pozorováno u zdravých dárců (obr. 2E)., To naznačuje, že přítomnost replikace JCV v ledvinách nemusí nutně vést k detekovatelnému JCV TEM v krvi. Naopak To zvyšuje možnost, že detekce JCV TEM v krvi může odrážet probíhající extrarenální replikaci JCV.

Ve studii román JCV enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) metoda (17), odhadovaná seroprevalence JCV u pacientů s RS léčených natalizumabem byla 53,6% (17). Séropositivita nemusí nutně korelovat s přítomností tem odpovědí, která souvisí s reaktivací viru., Plazmatické buňky s dlouhou životností mohou přetrvávat v kostní dřeni po dlouhou dobu, možná po celá desetiletí, udržování trvalých titrů sérových protilátek bez replikace aktivních patogenů (18, 19). Použili jsme stejnou metodu ELISA k testování 56 našich pacientů s MS léčených natalizumabem, kteří byli testováni JCV ELISPOT, včetně pacientů s 2 PML. Jak je znázorněno na obr. 2F, 53,6% pacientů, kteří byli séropozitivní a 16,1% bylo ELISPOT pozitivní. Dvacet sedm procent JCV-séropozitivních pacientů mělo detekovatelný JCV TEM v krvi. Pouze jeden pacient, který byl JCV ELISPOT pozitivní, byl séronegativní., Podle Gorelik et al., falešně negativní míra sérologického testu JCV je 2, 5% (17).

naše výsledky ukazují, že frekvence detekce odpovědí JCV TEM u pacientů s MS se zvyšuje s časem na natalizumabu. Předchozí studie také ukázala, zvýšení T-buněčné odpovědi na JCV po 12 měsících terapie natalizumabem, ale tato studie byla omezena na 18 měsíců léčby (20), vzhledem k tomu, že jsme zjistili, že nejsilnější nárůst v efektorové T buňky odpovědi došlo po 24 měsících.,

naše výsledky tak poukazují na reaktivaci JCV během léčby natalizumabem, a to i v extrarenálních lokalitách. JCV byla zjištěna v mozku HIV-séronegativních jedinců bez PML (21). Snížená CNS imunosurveillance indukovaná natalizumabem může upřednostňovat lokální reaktivaci viru, která může začít asymptomatickou intermitentní replikací viru, ale může se vyvinout k trvalé replikaci viru a poté k PML. Reaktivace viru by mohla aktivovat periferní specifické T lymfocyty prostřednictvím buněk prezentujících antigen v místech, jako jsou cervikální lymfatické uzliny vypouštějící mozek (22-24)., Vzhledem k tomu, že natalizumab cílí na receptor VLA-4, tyto specifické buňky nemohou účinně překročit hematoencefalickou bariéru a mohou se tak hromadit v krvi, což usnadňuje jejich detekci. PML je také komplikací infekce HIV v pozdním stádiu. Zda detekce JCV specifických efektorových CD4 a CD8 T buňky mohou předcházet AIDS-související PML je bod zájmu, který si zasluhuje další zkoumání. PML spojená s AIDS se však jasně liší od PML indukovaného natalizumabem., Většina pacientů infikovaných HIV, u kterých se vyvine PML, má hlubokou CD4 lymfopenii, která také mění funkčnost CD8 T buněk nedostatkem pomoci CD4 (25). Navíc, na rozdíl od pacientů na natalizumabu, neexistuje blokáda obchodování s T buňkami přes hematoencefalickou bariéru, což může zabránit akumulaci TEM v krvi specifické pro JCV.

Spolu, naše výsledky naznačují, že funkční testy schopné zjistit JCV specifických TEM odpovědí by mohla pomoci identifikovat pacienty s rizikem vzniku PML v průběhu léčby přípravkem protilátky, které inhibují lymfocyty obchodování přes krev-bariéra mozku.,