Hranic, v Mikrobiologii

Obrázek 2. Schematický diagram tří Saccharomyces cerevisiae replikativní DNA polymeráz α, δ a ε., Pro srovnání je ukázána DNA polymeráza z bakteriofágu RB69.

Tabulka 2. Kompilace DNA polymeráz rodiny B známé struktury.

Mechanismus Vyřazení Polymeráza

RNA/DNA oligonukleotid zachyceny v krystaly přijme-formulář konformaci, jak se očekávalo. Doména palce se zabývá více interakcemi s primerem RNA, a to jak prostřednictvím hydrofobních kontaktů, tak polárních interakcí (Perera et al., 2013)., Experimenty v roztoku ukázaly, že rozšíření primeru RNA o pol α je omezeno na 10-12 nukleotidů, což činí jednu otáčku šroubovice. Toto pozorování vedlo autory navrhnout mechanismus pro ukončení primer syntézy pol α, v němž ztráta specifických interakcí mezi palcem a RNA by vyvolat polymeráza se odpoutat od DNA/RNA oligonukleotid, a umožnit ruku do replikační polymerázy.,

Pohyby v Dlani Domény může Usnadnit Translokaci Pol α

S vykrystalizovala enzymu ve třech státech (apo, binární a ternární) umožnilo autorům překrytí všechny tři strukturální modely. Pol α je jediná eukaryotická rodina B DNA polymerázy, pro kterou byly všechny tři státy zachyceny v krystalové struktuře. Strukturální superpozice vyplynulo, že kromě dobře zdokumentované pohyby prstů a palce subdomény doprovodné substrátu závazné a nucleotidyl převodu, palm subdoménu sám prochází strukturální přeskupení (Perera et al.,, 2013). Autoři navrhují, že různé konformace palmové domény by mohly usnadnit translokaci pol α podél a mimo duplex RNA/DNA. Jak již bylo zmíněno výše, ztráta kontaktů do RNA strand, předpokládá se, vyvolat uvolnění nátěr, který pak bude k dispozici pro rozšíření pol δ nebo ε.,

Jiný Protein Složit v Inaktivované Exonuclease Subdomény

korektury činnost je zrušena v pol α, v důsledku mutace ve všech čtyřech carboxylates (Asp114/Glu116/Asp222/Asp327 v RB69 gp43 odpovídají Ser542/Gln544/Tyr644/Asn757 ve struktuře založené na zarovnání) (Tabulka 2). Navíc β-vlásenka motiv nalézt ve většině polymerázy B rodina (zbytky 246-267 v RB69 gp43) je nahrazena šikmými regionu v pol α (zbytky 667-676; 681-693) (Hogg et al., 2007)., Β-vlásenka je součástí exonuclease domény a bylo prokázáno, že v T4 a RB69 pols k účasti na rozdělení DNA primer mezi polymerázy a exonuclease aktivní místo (Reha-Krantz, 1988; Stocki et al., 1995; Hogg et al., 2007). Při absenci korektury není divu, že tento motiv nebyl v pol α zachován. Zbytky Jeho 684 a Phe 685 šikmými regionu v pol α zásobníku s thyminem a guanin základnu, respektive na pozice -3 a -2 v nepárové 5 end šablony (Perera et al., 2013)., Tak, v pol α regionu odpovídající β-vlásenka motiv přijímá různé fold (šroubovice vs. β prameny) a různé funkce (stabilizace nespárované oblasti prvku šablony, spíše než usnadnění aktivní místo přepínání). Od pol α je bez korektury činnost, vyvstává otázka, zda krátké oligonukleotidy jsou opraveny, a pokud ano, jakým DNA polymerázy. Zdá se, že korektura primerů syntetizovaných pol α se provádí pol δ (Pavlov et al., 2006a).,

DNA polymeráza δ

lidský pol δ se skládá ze čtyř podjednotek, zatímco Saccharomyces cerevisiae má tři (Gerik et al., 1998; Liu et al., 2000) (Tabulka 1). Kromě své funkce v replikaci DNA bylo prokázáno, že pol δ hraje roli při opravě a rekombinaci DNA (Hubscher et al., 2002; Lee et al., 2012; Tahirov, 2012). P12, nejmenší podjednotka v lidské pol δ a také podjednotka, která není vidět u pučících kvasinek, je degradována v reakci na poškození DNA (Lee et al., 2014). Katalytická podjednotka kvasnic pol δ (POL3) se skládá ze 1097 zbytků., Konstrukce použitá pro krystalizaci obsahuje zbytky 67-985 a postrádá tak CTD (Obrázek 1; Tabulka 2).

Třetí Kovových Iontů v Aktivním Místě Polymerázy

palm doména obsahuje tři konzervované carboxylates (Asp608, Asp762, a Asp764). Oba katalytické aspartáty, Asp608 a Asp764, kontaktují dva kovové ionty (Ca2+) v aktivním místě polymerázy oddělené 3,7 Å. Zajímavě byl pozorován třetí kov koordinovaný γ fosfátem přicházejícího nukleotidu a Glu802, s Glu800 v okolí., Mutace obou glutamátů na alanin přinesla polymerázovou variantu se sníženou účinností inkorporace pro správné i nesprávné nukleotidy (Swan et al., 2009). Na těchto pozicích aminokyselin, pol α a pol ε mají také karboxylát zbytky (pol δ Glu800/Glu802 odpovídají pol α Asp1033/Asp1035, a pol ε Glu945/Asp947). Zda tyto karboxyláty hrají podobné role v pol α a ε, se teprve zkoumá.,

High Fidelity a Korektury

Lidské pol δ je high-fidelity polymeráza, katalyzující nucleotidyl převod reakce s chybou frekvence 1 za 22,000 (Schmitt et al., 2009). Korektura zvyšuje věrnost polymerázy faktorem 10-100 (Mcculloch a Kunkel, 2008; Prindle et al., 2013). Pol δ má aktivní místo polymerázy a exonukleázy, oddělené asi 45 Å (Swan et al., 2009). DNA polymerázy s korekturou jsou schopny vnímat chybně zaznamenané nukleotidy kontaktováním menší drážky párů bází za místem vložení., Protein interaguje s univerzálními akceptory vodíkové vazby v N3 a O2 pozicích purinů a pyrimidinů (Seeman et al., 1976; Doublié et al., 1998; Franklin et al., 2001). Tyto vodíkové kontakty jsou zachovány, když základní pár přijme geometrii Watson-Crick a ztratí se v případě nesouladu. V RB69 gp43 se kontakty rozšiřují na první dva základní páry za rodící se základní pár (Franklin et al., 2001; Hogg et al., 2004, 2005). Kontakty jsou v polštině mnohem rozsáhlejší a rozšiřují se na pět párů bází po vložení (Swan et al.,, 2009), což by mohlo přispět k jeho vysoké věrnosti.

Jak bylo uvedeno výše, β-vlásenka segmentu z exonuclease doména hraje klíčovou roli v rozdělení DNA mezi polymerace a korektury míst v T4 a RB69 pols (Stocki et al., 1995; Hogg et al., 2007). V rb69 gp43 motiv β-vlásenky přijímá různé konformace, v závislosti na tom, zda byl komplex získán nepoškozenou DNA (Franklin et al., 2001; Zahn et al., 2007) nebo DNA obsahující poškození (Freisinger et al., 2004; Hogg et al., 2004)., Bylo plně vizualizováno kontaktování jak primeru, tak šablonových pramenů v komplexu s thyminovým glykolem (Aller et al., 2011). Podobně, β-vlásenka v pol δ vyčnívá do hlavní drážky DNA a působí jako klín mezi double-stranded DNA a single-stranded 5 end šablony pramen, který je stabilizován pomocí dvou aromatických reziduí Phe441 a Tyr446 (Obrázek 1) (Swan et al., 2009). Poloha β vlásenky odpovídá roli při aktivním přepínání místa.,

Interdomain Kontakty a Věrnosti

Mutace zapojené v rakovině jsou většinou nacházejí v exonuclease domény pol δ a ε, s důrazem na rozhodující úlohu korektury ve snížení výskytu mutace (Church et al., 2013; Henninger and Pursell, 2014). Jedna mutace v lidských kolorektálních nádorových buňkách se lokalizuje na doménu prstů, r689w. analogická mutace v kvasinkách (R696W) má za následek mutační fenotyp (Daee et al., 2010)., Mutace v blízkosti Arg696 ve vysoce konzervovaným motivem B prstů subdoménu kvasinek pol δ (A699Q) také výsledky v mutator fenotyp. Tato oblast prstů je v těsné blízkosti NTD. Mutující Met540 z NTD alanin ruší mutator fenotyp A699Q, které dokládají, že interakce mezi prsty a NTD může mít vliv na věrnost polymerázy (Prindle et al., 2013)., Podobně jako v T4 a RB69 pols NPL základní motiv, který zahrnuje zbytky z N-terminální a palm domény, je v kontaktu s prsty domény a bylo prokázáno, že stabilizovat polymeráza-DNA komplexy (Li et al., 2010).

DNA Polymeráza ε

katalytické podjednotky DNA polymeráza ε je produkt velmi velký gen (2222 aminokyselin v kvasinkách; 2286 lidí), a je jen třetí co do velikosti po polymerázové ζ (také člen rodiny B) a pol θ, rodina polymerázové (3130 a 2590 aminokyselin, respektive u lidí) (Lange et al.,, 2011; Hogg and Johansson, 2012) (Obrázek 1; Tabulka 2). Pol ε je dvakrát větší než pol δ a skládá se ze dvou oblastí tandemové polymerázy/exonukleázy. N-terminální segment má jak polymerázu, tak korekturu, zatímco segment C-terminálu je inaktivován. Dva moduly exonukleázy-polymerázy jsou vzdáleně příbuzné (Tahirov et al., 2009). I když inaktivovaná segmentu se předpokládá, hrát strukturní roli při replikaci, dvě skupiny byly schopny krystalizovat katalyticky aktivní pol ε konstrukce (zbytky 1-1228; 1-1187) chybí celý C-terminální modul (Hogg et al.,, 2014; Jain et al., 2014a). Obě krystalové struktury byly ternárního komplexu polymerázy, dna primeru / šablony a příchozího nukleotidu.

nová doména Procesivity vycházející z domény Palm

pol ε se liší od pol δ tím, že nevyžaduje dna posuvnou svorku PCNA pro vysokou procesivitu (Hogg a Johansson, 2012). Palmová doména pol ε je podstatně větší (380 reziduí) než u pol α nebo δ (175 a 203 reziduí)., Nedávné pol ε krystalové struktury vyplynulo, že inzerce v dlani domény společně tvoří novou doménu skládající se ze tří β prameny a dvě šroubovice (zbytky 533-555; 682-760) (Hogg et al., 2014; Jain et al., 2014a) (Obrázek 1; tabulka S1). Odstranění zbytků 690-751 vedlo k variantě se sníženou aktivitou polymerázy. Kromě toho mutace pozitivně nabitých zbytků (His748, Arg749 a Lys751) umístěných v blízkosti fosfátové páteře ovlivnila procesivitu enzymu (Hogg et al., 2014)., Další doména pocházející z dlaně byla tak pojmenována podle své funkce jako doména procesivity nebo P. Základem domény P je kovové vazebné místo (viz níže) (Hogg et al., 2014; Jain et al., 2014a, b).

Železo, Síra Clusteru v Polymerázové Domény

Nečekaně řešení studie odhalila, že katalytická podjednotka kvasinkové polymeráza ε sám obsahuje clusteru v jeho polymerázové fold (Jain et al., 2014b), kromě clusteru v CTD (Obrázek 2; Tabulka 2)., Druhá skupina v pol ε naznačuje, že tato polymeráza může být citlivější na oxidační stres (Jain et al., 2014b). Krystalové struktury pol ε však neodhalily cluster v polymerázové doméně (Hogg et al., 2014; Jain et al., 2014a; Zahn a Doublié, 2014). Dva z cysteinových zbytků jsou ve strukturálních modelech narušeny a výsledné kovové vazebné místo se zdá vázat zinek (Hogg et al., 2014; Jain et al., 2014a). Substituce a nepůvodním zinkem v kovově vázaných proteinech není neobvyklá (Netz et al., 2012) jako klastry jsou labilní., Vizualizace uvnitř polymerázové domény pol ε může vyžadovat anaerobní podmínky.

Krátké β-Vlásenka Motiv v Exonuclease Domény

V každém DNA polymeráza přechovávání obě polymerázy a exonuclease činnosti vázané DNA je v rovnováze mezi dvě aktivní centra (Beechem et al., 1998). Koncentrace příchozí nukleotidů a přítomnost poškození základny nebo mispair jsou dva faktory, které ovlivňují přenos DNA polymerázy aktivovat stránky korektury aktivní stránky., Polymerázy sledovat drobné drážky straně nově vzniklých párů bází a komunikovat s univerzální H vazba akceptory, O3, N2, jako způsob, jak kontrolovat pro nesoulad (Seeman et al., 1976; Franklin et al., 2001). Unikátní vlastností pol ε je kontakt na hlavní drážkovou stranu rodícího se základního páru přes zbytek z exonukleázové domény Tyr431. Další analýza je oprávněna objasnit potenciální roli tohoto tyrosinu ve vysoké věrnosti pol ε.,

V pol δ β-vlásenka segmentu vloží se na DNA a působí jako klín mezi jednovláknové a dvouvláknové DNA (Swan et al., 2009). V E. coli DNA pol II vložení β barelu posune polohu β vlásenky takovým způsobem, že polymerace je upřednostňována před korekturou (Wang a Yang, 2009). Tato modifikace pravděpodobně umožňuje této polymeráze provádět rozšíření syntézy transleze., Od pol ε je přesné DNA polymerázy předpoklad, než znalost krystalové struktury by se stát, že β-vlásenka by měl být blíže k pol δ než E. coli Pol II. Překvapivě, β-vlásenka s motivem pol ε je zkrácen, příliš krátká na to, obraťte se na DNA (Obrázek 1). Který proteinový motiv by tedy mohl usnadnit aktivní přepínání stránek při snímání nesprávného chování? Doména P je dobrým kandidátem, protože má kontakty na prameny primerů i šablon; zbytky z domény P by mohly cítit chyby replikace, a tak mohou pomoci usnadnit aktivní přepínání stránek.,

Závěry

Všechny tři eukaryotní replikační DNA polymerázy používat společný B-rodina složit, a každý polymeráza má začleněny upravené konstrukční prvky, které jsou unikátní a na míru pro každý polymeráza je konkrétní funkci (např. přidání processivity domény v pol ε, processive polymerázy, která nepoužívá PCNA, nebo upravené regionu, kontaktování 5 end šablony v pol α, polymeráza postrádá proofreading aktivitu). Záhyb polymeráz rodiny B je vhodný pro vysoce věrné, replikativní polymerázy., Překvapivě je však také používán translezními polymerázami. Eukaryotická pol (nebo REV3L) je 353 kDa polymeráza, která funguje při syntéze transleze a zdá se, že potlačuje tumorigenezi (Wittschieben et al., 2010; Lange et al., 2011; Zahn et al., 2011; Hogg and Johansson, 2012; Sharma et al., 2013). Struktura E. coli Pol II odhalil změny v NTD, které ovlivňují pozici β-vlásenka z exonuclease domény, a tedy rozdělení DNA mezi polymerace a korektury míst (Wang a Yang, 2009)., Struktura pol ζ může odhalit podobné úpravy, které mění složit zaměstnán high-fidelity, replikační polymerázy k vykreslení enzymu méně věrný a schopen provádět translesion synthesis.

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Potvrzení

Tato práce byla podpořena grantem od National Institutes of Health (NCI R01 CA 52040).

doplňkový materiál