7.13 F: séquençage de L’ADN basé sur les Didésoxynucléotides de Sanger

le séquençage Sanger, également appelé séquençage de terminaison de chaîne, fait référence à une méthode de séquençage de par Frederick Sanger en 1977. Cette méthode est basée sur l’amplification du fragment D’ADN à séquencer par L’ADN polymérase et l’incorporation de nucléotides modifiés – en particulier des didésoxynucléotides (ddNTPs).,

la méthode classique de terminaison de chaîne nécessite un modèle D’ADN monocaténaire, une amorce D’ADN, une ADN polymérase, des désoxynucléotidétriphosphates normaux (dNTPs) et des nucléotides modifiés (didéoxyntps) qui terminent l’élongation des brins d’ADN. Ces nucléotides de terminaison de chaîne n’ont pas de groupe 3 ‘ – OH nécessaire à la formation d’une liaison phosphodiester entre deux nucléotides, ce qui fait que L’ADN polymérase cesse l’extension de l’ADN lorsqu’un ddNTP est incorporé. Les ddNTPs peuvent être marqués de manière radioactive ou fluorescente pour la détection dans des machines de séquençage automatisées.,L’échantillon D’ADN est divisé en quatre réactions de séquençage distinctes, contenant les quatre désoxynucléotides standard (dATP, dGTP, dCTP et dTTP) et L’ADN polymérase. A chaque réaction est ajouté un seul des quatre didésoxynucléotides (ddATP, ddGTP, ddCTP ou ddTTP). Après des séries d’extension d’ADN de gabarit à partir de l’amorce liée, les fragments d’ADN résultants sont dénaturés à la chaleur et séparés par taille à l’aide d’une électrophorèse sur gel. Ceci est fréquemment effectué en utilisant un gel de polyacrylamide-urée dénaturant avec chacune des quatre réactions exécutées dans l’une des quatre voies individuelles (voies A, T, G, C)., Les bandes D’ADN peuvent alors être visualisées par autoradiographie ou lumière UV et la séquence D’ADN peut être directement lue sur le film de rayons X ou l’image de gel.

les variantes techniques du séquençage de terminaison de chaîne comprennent le marquage avec des nucléotides contenant du phosphore radioactif pour le radiomarquage, ou l’utilisation d’une amorce marquée à l’extrémité 5′ avec un colorant fluorescent. Le séquençage Dye-primer facilite la lecture dans un système optique pour une analyse et une automatisation plus rapides et plus économiques. Le développement ultérieur par Leroy Hood et ses collègues de ddNTPs et d’amorces marqués par fluorescence a ouvert la voie à un séquençage automatisé à haut débit de l’ADN. Les méthodes de terminaison de chaîne ont grandement simplifié le séquençage de l’ADN., Plus récemment, le séquençage dye-terminator a été développé. Le séquençage Dye-terminator utilise l’étiquetage du terminateur de chaîne ddNTPs, ce qui permet le séquençage en une seule réaction, plutôt que quatre réactions comme dans la méthode de l’amorce marquée. Dans le séquençage dye-terminator, chacun des quatre terminateurs de chaîne didésoxynucléotide est marqué avec des colorants fluorescents, chacun émettant de la lumière à différentes longueurs d’onde.,

Les instruments automatisés de séquençage de L’ADN (séquenceurs D’ADN) peuvent séquencer jusqu’à 384 échantillons D’ADN en un seul lot (exécution) en 24 exécutions par jour., Les séquenceurs D’ADN effectuent l’électrophorèse capillaire pour la séparation de taille, la détection et l’enregistrement de la fluorescence de colorant, et la sortie de données sous forme de chromatogrammes de trace de crête fluorescente. L’automatisation a conduit au séquençage de génomes entiers.