Abstract
Purpose. A sarcoidose é uma doença granulomatosa sistémica com etiologia desconhecida. Muitas apresentações clínicas foram relatadas, e a doença aguda precisa ser distinguida da doença subaguda e crônica. O imprevisível curso clínico da doença levou-nos a avaliar a utilidade clínica da detecção sérica de biomarcadores no seguimento da sarcoidose. Meios., As concentrações séricas de chitotriosidase, ECA, KL-6 e lisozima foram analisadas por diferentes métodos numa população de 74 doentes com sarcoidose (46 tratados com terapêutica esteróide por amostragem) regularmente monitorizados no Centro Regional de referência da Siena sarcoidose e num grupo de controlos com o objectivo de comparar a sua contribuição para o tratamento clínico de doentes com sarcoidose. Resultado., As concentrações de KL-6 foram significativamente elevadas em doentes com sarcoidose com fibrose pulmonar e estavam significativamente correlacionadas com a pontuação DLco e IPC, enquanto a chitotriosidase foi significativamente mais elevada em doentes com localizações extrapulmonares. Com um valor-limite de 303, 5 UI / ml, o KL-6 mostrou a melhor sensibilidade (78%), enquanto a chitotriosidase indicou a melhor especificidade (85%) entre os biomarcadores. Conclusao. O KL-6 é um biomarcador fiável do envolvimento fibrótico pulmonar em doentes com sarcoidose., Entre os biomarcadores, KL-6 mostrou a melhor sensibilidade e chitotriosidase sérica a melhor especificidade, mesmo em pacientes em terapia com esteróides crônicos, e parecia correlacionar-se com localizações extrapulmonares.
1. A sarcoidose é uma doença granulomatosa sistémica associada à activação e migração dos linfócitos T e dos macrófagos para os órgãos afectados. A interação entre antigénios e APC polariza linfócitos T para o fenótipo T helper 1( Th1), levando à formação de granulomas sarcóides consistindo de células T, macrófagos e células epitelioides e gigantes ., O curso da sarcoidose é imprevisível: remissão ocorre na maioria dos casos, enquanto a inflamação persistente do granuloma pode levar a doença pulmonar fibrótica . Por conseguinte, são necessários biomarcadores específicos com boa sensibilidade e especificidade para prever o resultado clínico e orientar as decisões clínicas.a quitotriosidase humana é um biomarcador secretado por macrófagos e neutrófilos activados. Embora o seu papel fisiológico não seja claro, pode desempenhar um papel na hidrólise e degradação de substratos tipo quitina e quitina ., Foram notificadas concentrações aumentadas de chitotriosidase no soro e BAL de doentes com sarcoidose activa . A Chitotriosidase apresenta uma correlação com as fases radiológicas. Pode prever o ciclo clínico, a capacidade de resposta dos esteróides e potenciais recidivas da doença . No entanto, não é claro se a chitotriosidase é fiável no tratamento de doentes com sarcoidose com envolvimento de órgãos extrapulmonares.a enzima de conversão da angiotensina (ECA) é uma glicoproteína ácida que converte a angiotensina I em angiotensina II., É produzido por células endoteliais pulmonares, principalmente macrófagos alveolares ativados . É elevada no soro e BAL de pacientes com sarcoidose e suas concentrações estão correlacionadas com estágios radiológicos . No entanto, a sua utilidade como ferramenta de diagnóstico e prognóstico é limitada pela sua baixa sensibilidade e especificidade. A ECA pode ser elevada em certas doenças granulomatosas (incluindo beriliose e silicose), hipertiroidismo, diabetes e outras doenças .a lisozima é produzida pelo sistema monócito-macrófago e as células epitelióides envolvidas na formação de granulomas podem libertar esta enzima., Os doentes com sarcoidose apresentam uma concentração aumentada de lisozima no início. A lisozima é considerada mais como um indicador de prognóstico do que como uma ferramenta de diagnóstico. Tem uma baixa especificidade sendo elevada em doenças pulmonares como tuberculose e pneumoconiose .
Krebs von den Lungen-6 (KL-6) é uma proteína mucina de alto peso molecular humana derivada da AEC. As suas concentrações séricas estão elevadas em vários ILDs, incluindo fibrose pulmonar idiopática e sarcoidose ., Na sarcoidose, o KL-6 correlaciona-se com a actividade da ECA: aumenta principalmente nos doentes em fase 2 e 3 com evidência cintigráfica de acumulação pulmonar positiva . Níveis elevados de KL-6 séricos na sarcoidose reflectem a produção de KL-6 derivada de pneumócitos de tipo 2 danificados ou regeneradores .
neste estudo, comparamos os níveis séricos de diferentes biomarcadores em uma coorte de pacientes com sarcoidose crônica procurou correlações com fenótipos específicos, apresentação clínica e localizações.2. Materiais e métodos
2.1., População do estudo
incluímos retrospectivamente 74 doentes com sarcoidose (27 doentes do sexo masculino (36, 5%), com uma idade média de anos) regularmente monitorizados no Centro Regional de Arbitragem de Siena para a sarcoidose e para a ILDs. Todos os doentes foram diagnosticados de acordo com os critérios internacionais ATS/ERS/WASOG. Todos tinham estado em acompanhamento no nosso centro por mais de 2 anos desde o diagnóstico e mostrou uma doença crônica persistente. Os critérios de exclusão incluíram doentes com síndrome de Lofgren, aparecimento de doença aguda, resolução espontânea ou seguimento inferior a 2 anos.,foi realizada uma amostragem sérica
no recrutamento: no mesmo dia, foram realizados testes da função pulmonar (TFP) e raio-X torácico, com estadiamento radiológico de acordo com os critérios de classificação. A classificação radiológica foi associada à detecção de amostras de uma maneira padrão de acordo com critérios amplamente aceitos: fase 0, normal; Fase 1, adenopatia biliar sem envolvimento parênquimal; Fase 2, adenopatia bilateral e infiltração parênquima; Fase 3, infiltração parênquima; e Fase 4, fibrose pulmonar associada com sarcoidose., Todos os doentes foram submetidos a uma tomografia computadorizada do tórax (TCH) de alta resolução para verificar a fibrose pulmonar. Todos os sujeitos deram seu consentimento informado para o estudo, aprovado pelo Comitê de Ética Local. A fim de encontrar um valor-limite do KL-6 sérico na nossa população, recolhemos amostras de soro de 25 voluntários saudáveis (6 Homens, Idade Média), sem antecedentes de doenças respiratórias e sem tomar nenhum medicamento
2.2., Testes da função pulmonar
as seguintes medições da função pulmonar foram realizadas de acordo com parâmetros padrão ATS/ERS , usando um Pletismógrafo do corpo Jaeger com correções para a temperatura e pressão barométrica: volume expiratório forçado no primeiro segundo (FEV1), capacidade vital forçada (FVC), e monóxido de carbono do pulmão difuso (DLCO). Todos os parâmetros foram expressos em percentagem dos valores previstos .
2, 3., Os doentes com fenotipagem clínica
foram classificados com base no envolvimento radiológico dos pulmões e nas localizações da sarcoidose, de acordo com a recente relação genótipo-fenótipo no documento sobre sarcoidose (Genfenresa) , bem como na pontuação do Índice fisiológico composto (IPC). Calculámos o IPC em cada doente de acordo com a seguinte fórmula, como descrito anteriormente : 91 − ( dlco previsto) − ( FVC previsto) + .,
localizações extrapulmonares da doença foram avaliadas com vias diagnósticas específicas do órgão: envolvimentos do fígado, baço, osso, medula óssea, gânglios linfáticos extratorácicos, e pele foram todos biopsia comprovada, enquanto a localização cardíaca foi avaliada com o MR imaging.
2, 4. O doseamento da Chitotriosidase
a actividade da Chitotriosidase foi determinado por um método fluorimétrico de 22 µM 4-metilumbelliferil β-D-n,N,n-triacetilchitotriosidase (Sigma Chemical Co. em tampão citrato-fosfato, foi incubado pH 5, 2; 100 µl de substrato durante 1 h a 37°C e a reacção foi interrompida com 1, 4 ml 0.,1 M tampão glicina-NaOH, pH 10.8. Fluorescência foi lida a 450 nm com um PerkinElmer Victor X4 Fluorímetro (comprimento de onda de excitação 365 nm). A actividade sérica da chitotriosidase foi expressa em nmol/ml/h. os valores de normalidade foram calculados de acordo com os nossos estudos anteriores.
2, 5. O ensaio ACE
a actividade da ECA foi determinada utilizando um método colorimétrico (FAR srl, Verona, Itália) para a determinação da actividade da ECA no soro. O intervalo normal de concentrações ECA foi de 30-80 UI/l.
2, 6. Ensaio de lisozima
2, 7., O ensaio Krebs von den Lungen-6
Kl-6 sérico foi medido pelo ensaio dos reagentes NANOPIA® KL-6 (Sekisui Diagnostics, UK). O princípio do ensaio é a aglutinação do antigénio carboidrato sialilado em amostras com anticorpo monoclonal KL-6 através da reacção do antigénio-anticorpo. A variação da absorvância é medida para determinar os níveis séricos de KL-6. As concentrações de KL-6 são expressas em UI/ml.
2, 8. Análise estatística
os dados foram expressos como . Comparações entre os grupos foram realizadas por Mann-Whitney test e Kruskal-Wallis test com significância definida em ., O teste Spearman foi usado para procurar correlações entre variáveis. Análises estatísticas e curvas ROC foram realizadas usando o software Statistica v 7.0; representações gráficas de dados foram realizadas usando o software Prism 4.0 do GraphPad.
3. Resultados
3.1. Os parâmetros clínicos, radiológicos e funcionais
características demográficas, valores dos testes da função pulmonar e fases radiológicas da população estão descritos no quadro 1. Como esperado , o início ocorreu principalmente na 5ª década ( anos), prevalente em mulheres nunca fumadoras., No que se refere à história clínica, 46 doentes (62%, 17 homens) estavam a fazer terapêutica com esteróides na altura da amostragem sérica, com uma dose média de prednisona. Destes, todos menos um estavam a tomar esteróides orais há mais de um ano. 13 doentes (3 do sexo masculino) estavam a tomar medicamentos imunossupressores em associação com esteróides orais (12 com metotrexato, 1 com azatioprina). Entre o subgrupo isento de esteróides (28 doentes, 10 homens), apenas dois doentes nunca tinham tomado uma terapêutica específica para a sarcoidose.,
na nossa população, os parâmetros de TFP estavam no intervalo normal, sem alteração significativa dos volumes pulmonares: 63 doentes conseguiram realizar uma manobra aceitável para a DLCO que foi ligeiramente prejudicada, em média.
3, 2. A comparação da concentração sérica de KL-6 dos biomarcadores
foi calculada em todos os doentes e voluntários saudáveis; a ECA e a lisozima foram detectadas no soro de todos os doentes. Seis doentes com actividade de chitotriosidase <10 nmol/ml/h apresentavam suspeita de polimorfismo do CHIT1 e foram excluídos da análise.,não se observaram diferenças significativas nos níveis de biomarcadores entre os doentes tratados com esteróides e os tratados com esteróides e a terapêutica imunossupressora.
KL-6 estava significativamente correlacionado com a ECA (; ), a lisozima (;) e a actividade da quitotriosidase (; ) (Figura 1).,
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3.3. Organ Involvement and Phenotypes
The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., O mais comum extrapulmonar localizações foram a pele (16 pacientes, de 21,6%), baço (11 pacientes, 14.8%) e fígado (5 pacientes, 6.7%). As localizações menos frequentes foram os olhos (3 Doentes, 4% dos casos) e os gânglios linfáticos extratorácicos (3 Doentes, 4%); SNC (2 doentes, 2, 7% dos casos) e envolvimento cardíaco, ósseo ou da medula óssea (1, 3% dos casos). Os doentes com envolvimento extrapulmonar com sarcoidose tiveram uma actividade de chitotriosidase significativamente mais elevada do que os doentes com doença pulmonar limitada (; ) (Figura 3). Não foram observadas outras diferenças significativas em relação às localizações de órgãos.,
em relação aos fenotipos de Genfenresa, os doentes com envolvimento abdominal () mostraram actividade de quitotriosidase significativamente mais elevada do que os doentes com envolvimento ocular-cardíaco-cutâneo-central do sistema nervoso (OCC) (), músculo-esquelético-cutâneo () e envolvimento pulmonar isolado () (, respectivamente; )., Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os níveis de KL-6, ECA e lisozima nestes subgrupos.
de acordo com a pontuação radiológica, os doentes com sarcoidose fibrótica (Fase 4) mostraram as concentrações séricas mais elevadas de KL-6 em comparação com as outras fases radiológicas da doença () (Figura 4).
4., Discussão
muitos biomarcadores foram propostos para a sarcoidose, mas nenhum revelou um valor prognóstico satisfatório para a identificação de recidiva sob terapia ou localização de órgãos vitais. Neste estudo, comparamos diferentes biomarcadores de sarcoidose. Selecionamos pacientes com doenças crônicas em tratamento por mais de 1 ano com dados clínicos e demográficos compatíveis com as características gerais da sarcoidose relatadas na literatura . Incluímos o KL-6 na lista de biomarcadores, embora esta proteína tenha sido estudada em IPF e estejam disponíveis poucos dados sobre o seu papel na sarcoidose., O nosso interesse no KL-6 estava relacionado com a sua correlação relatada com o envolvimento fibrótico grave do pulmão e a baixa sobrevivência . A Chitotriosidase, a ECA e a lisozima apresentaram uma menor prevalência na nossa população do que a observada anteriormente, provavelmente porque a maioria dos doentes estavam a receber tratamento sistémico a longo prazo com esteróides e não apresentavam sinais de doença activa na altura da amostragem sérica. Pelo contrário, o KL-6 mostrou uma boa sensibilidade e especificidade na nossa população, com um valor-limite de 303,5 UI/ml., Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a investigar um determinado valor de cut-off de KL-6 na sarcoidose crônica versus um grupo de controles saudáveis; no entanto, este não era o principal objetivo do estudo e os dados precisam ser validados em um amplo grupo de pacientes. Os nossos resultados confirmaram o valor preditivo de KL-6 para o envolvimento fibrótico pulmonar e insuficiência funcional em doentes com sarcoidose ILD já notificados por Miyoshi et al., ; no entanto, nosso estudo é o primeiro que mostra uma correlação significativa entre um biomarcador sérico, KL-6, e envolvimento pulmonar fibrótico em pacientes com sarcoidose, quantificado pelo Índice de IPC. Além disso, esta constatação é ainda confirmada por uma correlação significativa com as percentagens de DLCO, sustentando a utilidade potencial de medições de KL-6 para avaliar a gravidade da sarcoidose no tratamento clínico destes doentes., Estes dados foram consistentes independentemente do estado terapêutico, sugerindo uma activação macrófaga crónica sem resposta à terapêutica com esteróides, em particular nos doentes com doença pulmonar fibrótica. Não foram encontradas diferenças significativas de expressão de KL-6 entre os fenótipos clínicos e/ou localizações extrapulmonares, indicando que o KL-6 pode ser considerado confiável apenas para o envolvimento pulmonar da doença. Foram detectadas correlações positivas entre os biomarcadores da sarcoidose, incluindo ACE, lisozyme, chitotriosidase e KL-6, que podem, portanto, ser incluídos na lista de indicadores prognósticos.,
Por outro lado, a chitotriosidase revelou-se mais sensível do que a ECA, a lisozima e a KL-6 mesmo em doentes sob tratamento sistémico; também parece ser o único biomarcador que pode reflectir o envolvimento extratorácico, de acordo com a recente classificação do fenótipo clínico de Genfenresa., Em particular, a sua expressão é mais pronunciado em pacientes com órgãos abdominais localizações (o fígado e o baço, em que a nossa população), provavelmente devido a uma sobreexpressão activada residente macrófagos; estes dados sugerem que chitotriosidase pode ser um forte marcador de ativação do sistema retículo-endotelial na sarcoidose, como já relatado em pacientes com lysosomal storage doença . Não existem estudos disponíveis sobre o valor prognóstico da chitotriosidase nas localizações da sarcoidose esplênica e hepática, e esta é uma novidade relevante deste estudo., Ao contrário de KL-6, a actividade da chitotriosidase parece não estar correlacionada com a gravidade do envolvimento pulmonar sarcóide ou insuficiência funcional, sugerindo que diferentes padrões de activação dos macrófagos podem estar presentes no sistema respiratório dos doentes com sarcoidose e influenciar a expressão dos biomarcadores .em conclusão, os doentes com sarcoidose crónica, envolvimento extrapulmonar grave ou compromisso fibrótico de Fase 4 representam um alvo importante que requer a identificação de biomarcadores de prognóstico fiáveis para prever a recidiva da doença e a resposta ao tratamento sistémico.,com base nestes resultados preliminares, foram observados níveis elevados de chitotriosidase e KL-6 (e não ECA ou lsysozyme) em doentes com sarcoidose crónica, independentemente da terapêutica. A actividade da Chitotriosidase foi significativamente mais elevada em doentes com envolvimento de múltiplos órgãos, mostrando uma fiabilidade promissora para a avaliação da sarcoidose multisistémica. Pelo contrário, os níveis de KL-6 correlacionados com o envolvimento fibrótico do pulmão, a pontuação de IPC, e as percentagens reduzidas de DLCO sugerem um papel potencial como um marcador de gravidade da sarcoidose pulmonar., Curiosamente, estes achados foram relatados em uma população de pacientes crônicos com sarcoidose multirregana, incluindo aqueles em tratamento, expandindo a confiabilidade da chitotriosidase e KL-6 Também neste contexto.
disponibilidade de dados
os conjuntos de dados gerados durante e / ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis do autor correspondente, a pedido razoável. Os dados estão disponíveis em Laura Bergantini ([email protected]) e Elena Bargagli ([email protected]) para os investigadores que satisfaçam os critérios de acesso a dados confidenciais.,
conflitos de interesses
os autores declaram que não têm conflitos de interesses.as contribuições dos autores, Laura Bergantini e Francesco Bianchi, contribuíram igualmente para o estudo.
agradecimentos
o presente trabalho foi realizado na Universidade de Siena.
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