TEXTO

Natalizumab, um anticorpo utilizado para tratar a hipercalcemia e a esclerose múltipla (MS), impede que o tráfico de ativação de linfócitos, incluindo linfócitos auto-reativos, através da barreira sangue-cérebro (BBB). O principal efeito adverso do natalizumab é a leucoencefalopatia multifocal progressiva (LMP), uma doença desmielinizante devastadora causada pela replicação do poliomavírus humano JC (JCV) em oligodendrocitos e astrocitos (1, 2)., A inibição do Natalizumab do tráfico de células T efectoras do sangue para o sistema nervoso central (SNC) pode favorecer a replicação local do VCJ (3-7).examinámos aqui a presença de células T da memória efectora específica do JCV (met) no sangue de doentes com EM após a activação overnight do antigénio ex vivo. In vivo, os números GDT específicos diminuem uma vez que o antigénio cognato é limpo (8-10), e a sua presença pode, assim, apontar para a replicação em curso da ECCV. O Met liberta rapidamente citoquinas, tais como o interferão gama (IFN-γ), quando reexposto ao antigénio., Uma análise prévia da expressão IFN-γ nas células T após activação a longo prazo com peptídeos JCV durante um período máximo de 14 dias (11) examinou a presença de um doseamento imunoabsorvente enzimático (ELISPOT) nas células T, após activação a longo prazo com peptídeos JCV. No entanto, a ativação prolongada permite que a memória de células T Quiescentes a longo prazo seja reativada e expandida, o que significa que uma resposta positiva não significa necessariamente uma resposta imune contínua. Aqui, primeiramente examinamos a presença de GDT-específico JCV em dois pacientes em esclerose múltipla que desenvolveram LMP. O primeiro doente foi diagnosticado com LMP após 39 meses com natalizumab (39 infusões) (Departamento de Neurologia, Hospital Pitié-Salpétrière)., Ela tinha 39 anos e tinha uma história de 10 anos de esclerose múltipla por surtos de exacerbação / remissão Antes de natalizumab, tinha recebido ciclofosfamida e mitoxantrona. A LMP foi confirmada por IRM e PCR JCV no líquido cefalorraquidiano (LCR). Quando testada para o Met específico do JCV, 8 semanas após o início dos sintomas da LMP, ela tinha 1,040 cópias do genoma do JCV por ml do LCR (JCV Q-PCR Alert kit; Nanogen Advanced Diagnostics). As células mononucleares do seu sangue periférico (PBMC) foram activadas in vitro no meio AIM-V e Albumax (Invitrogen) durante 16 h com iCCM purificada (estirpe MAD-4; LGC Promochem; 104, 5 50% da dose infecciosa da cultura de tecidos /0, 2 ml)., Não foi adicionada interleucina recombinante 2 (IL-2). Foi adicionada a cada poço uma quantidade de vírus correspondente a 5.534 PFU. Isto correspondeu a uma multiplicidade de infecções (MOI) de 0, 02. As células foram então testadas para IFN-γ intracelular por citometria de fluxo. A mortalidade celular após a activação nocturna foi inferior a 5%. Como mostrado na Fig. As células 1A e andB, B, respondentes foram detectadas tanto nos subconjuntos de células T CD4 e CD8, e a maioria deles tinha o fenótipo CCR7-CD45RA característico dos efetores de memória (12)., Anti-JCV TEM também foram detectados por IFN-γ ELISPOT (captura e detecção de anticorpos, clones 1-D1 e K7-B6-1, respectivamente; Mabtech) após 16 h de ativação com purificada JCV ou VP-1 peptídeos (uma mistura de 14 piscinas de sobreposição de 15 de aminoácidos peptídeos, cobrindo toda a JCV VP-1 de proteína ) (Fig. 1C). O segundo doente tinha 46 anos de idade e tinha uma história de 11 anos de esclerose múltipla por surtos de exacerbação / remissão Antes de natalizumab, tinha recebido interferão beta, acetato de glatirâmero, azatioprina e mitoxantrona. Ela foi encaminhada para o Hospital Tenon hospital centro de reavaliação após 24 perfusões de natalizumab., Uma ressonância magnética cerebral realizada em maio de 2012 detectou uma pequena lesão suspeita T2-hiperintensa, linear, na região frontal direita juxtacortical. A primeira amostra do LCR foi negativa para a JCV. Repetir a IRM após a retirada do natalizumab revelou um aumento do tamanho da lesão, levando a dois exames no LCR adicionais, ambos negativos para JCV. A PCR JCV no plasma foi realizada 2 e 4 meses após o início da LMP. Ambas as amostras de plasma deram negativo. A biópsia cerebral realizada em setembro de 2012 finalmente confirmou o diagnóstico de LMP.,

detecção de células T efectoras específicas da JCV (met) no sangue de dois doentes com LMP tratados com natalizumab. Nos painéis A e B, A CPSP de um doente que desenvolveu LMP após o tratamento com natalizumab (39 perfusões) foi activada com vírus JC purificado durante a noite e depois testada para detecção de IFN-γ intracelular por citometria de fluxo nos subconjuntos das células T CD4 e CD8 (a e B, respectivamente). A expressão CCR7 e CD45RA em células IFN-γ-positivas e-negativas também é mostrada para as células T CD4 (a) e T CD8 (B)., No painel C, A CMSP de 2 doentes que desenvolveram LMP com natalizumab (o doente 1 e o doente 2 receberam 39 e 24 perfusões, respectivamente) foi activada durante a noite com vírus JC purificado e/ou com um conjunto de peptídeos de MP1 antes da ELISPOT IFN-γ. O número de pontos IFN-γ Por 0, 25 × 106 PBMC após activação nocturna com piscinas JCV purificadas e peptídeo JCV foi de 54 e 21, respectivamente (bem não tratado, 0 pontos) no doente 1. No paciente 2, JCV purificado produziu 15 manchas (bem não tratado, 0 manchas).,

ELISPOT análise da resposta IFN-γ À JCV, realizada 2 dias após a última perfusão de natalizumab, mostrou a presença de MET específico da JCV no sangue (Fig. 1C). Curiosamente, os números de MET específicos de JCV circulantes foram mais baixos do que no primeiro paciente de LMP, que pode ter tido um nível mais elevado de replicação de JCV no cérebro, uma vez que a PCR de JCV no LCR foi positiva no primeiro paciente e negativa no segundo.,

examinamos, também, a presença de JCV-específica TEM por ELISPOT em uma série de MS 62 pacientes com hipercalcemia e remissão MS tratados com natalizumab de acordo com a European termos de mercado, bem como em 35 MS pacientes que não estavam recebendo qualquer modificadoras da doença, terapia, um grupo de 40 dadores saudáveis pareados por idade e sexo com o MS pacientes. As características dos doentes em são apresentadas na Tabela 1. Os pacientes e doadores saudáveis deram seu consentimento por escrito para participar do estudo, que foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Pitié-Salpêtrière, Paris., Uma resposta ELISPOT foi considerada positiva se o número corrigido de pontos (Número de pontos em poços ativados menos número de pontos em poços não tratados) foi pelo menos 10, com menos de 10 pontos em poços não tratados.a proporção de amostras positivas foi de 2, 5% em dadores saudáveis (Fig. 2A). No grupo em, A percentagem de doentes positivos aumentou com o tempo de tratamento com natalizumab (Fig. Nos doentes tratados com natalizumab durante menos de 24 meses e 27% nos doentes tratados durante mais de 24 meses (Fig., 2C) (significativa para doentes tratados durante mais de 24 meses versus em não tratados e Versus indivíduos de controlo). Este aumento na frequência de detecção das respostas GDT em JCV sugeriu que o tratamento prolongado com natalizumab favoreceu a reactivação de GCV.

aumento da detecção de GDT específica em doentes tratados com natalizumab. Os painéis A e B representam o número de pontos IFN-γ Por 0, 25 × 106 PBMC após activação nocturna com vírus JC purificado em 40 dadores saudáveis (a) e em 99 doentes em, De acordo com o tempo de natalizumab (B)., No painel B, os 2 doentes com LMP são indicados por um triângulo fechado e um quadrado fechado. A linha tracejada representa o corte de positividade (veja o texto). O painel C representa a percentagem de amostras JCV-ELISPOT positivas em dadores saudáveis (HD), doentes de controlo (em não tratados) e doentes tratados com natalizumab durante 2 anos (0-24 meses) ou mais (24-48 meses). Alguns doentes tratados com natalizumab foram testados em 2 ou 3 pontos temporais. O número de amostras de sangue analisadas é indicado abaixo. A análise estatística usou o teste do Fisher., O painel D mostra os resultados de ELISPOT JCV para os doentes que foram testados em 2 ou 3 pontos temporais. O painel E mostra os resultados da PCR e do ELISPOT urinários JCV em 50 doentes com em tratados com natalizumab e em 14 dadores saudáveis testados com ambos os ensaios. O painel F mostra resultados de serologia JCV e ELISPOT JCV em 56 doentes em MS tratados com natalizumab testados com ambos os ensaios.

um subgrupo de doentes tratados com natalizumab foram submetidos a amostragem pelo menos duas vezes (ver Quadro 1). Como mostrado na Fig. 2D, a maioria destes doentes tornou-se ou manteve-se positiva durante o período de amostragem.,

O rim é um grande reservatório para JCV. Uma porcentagem significativa da população em geral excreta o vírus em sua urina, mas não tem evidência de JCV em seu sangue (13-15). Além disso, a presença de ADN JCV no cérebro parece ser independente da sua presença no rim (16). Como mostrado na Fig. 2e, 60% dos doentes com EM com ECT detectáveis no sangue não apresentavam ect detectáveis na urina, e 69% dos doentes com PCR positivo na urina com ECCV não apresentavam ect detectáveis. Observou-se também excreção urinária de ECV sem GDT detectável em dadores saudáveis (Fig. 2E)., Isto sugere que a presença de replicação JCV no rim não leva necessariamente a ECV no sangue detectável. Inversamente, isto levanta a possibilidade de que a detecção JCV met no sangue possa reflectir a replicação extra-renal em curso.

num estudo utilizando um novo método de imunoabsorção enzimática associada ao JCV (ELISA) (17), a seroprevalência estimada do JCV em doentes com em tratados com natalizumab foi de 53, 6% (17). A seropositividade não está necessariamente correlacionada com a presença de respostas GDT, que está relacionada com a reactivação do vírus., As células plasmáticas de longa duração podem persistir na medula óssea durante longos períodos de tempo, talvez durante décadas, mantendo títulos de anticorpos séricos mantidos sem replicação activa do patogéneo (18, 19). Usámos o mesmo método ELISA para testar 56 dos nossos doentes com em tratados com natalizumab que tinham sido testados por JCV ELISPOT, incluindo os 2 doentes com LMP. Como mostrado na Fig. 2f, 53, 6% dos doentes eram seropositivos e 16, 1% eram ELISPOT positivos. Vinte e sete por cento dos doentes seropositivos a JCV apresentavam GDT detectável no seu sangue. Apenas um doente que era JCV ELISPOT positivo foi seronegativo., De acordo com Gorelik et al., a taxa falso-negativa do doseamento serológico JCV é de 2, 5% (17).os nossos resultados mostram que a frequência de detecção das respostas GCV em doentes com EM aumenta com o tempo de tratamento com natalizumab. Um estudo anterior também mostrou um aumento nas respostas das células T à JCV após 12 meses de terapêutica com natalizumab, mas este estudo foi limitado a 18 meses de tratamento (20), enquanto que descobrimos que o aumento mais forte nas respostas das células T efectoras ocorreu após 24 meses.,os nossos resultados apontam para reactivação JCV durante a terapêutica com natalizumab, incluindo em locais extra-renais. A VCJ foi detectada no cérebro de indivíduos seronegativos do VIH sem LMP (21). A imuno-vigilância diminuída do SNC induzida pelo natalizumab pode favorecer a reactivação do vírus local que pode começar como replicação assintomática intermitente do vírus, mas pode evoluir para replicação sustentada do vírus e depois para LMP. A reactivação do vírus pode activar linfócitos T específicos periféricos, através de células apresentadoras de antigénios, em locais como os gânglios linfáticos cervicais drenantes do cérebro (22-24)., Uma vez que o natalizumab se destina ao receptor VLA-4, Estas células específicas não podem atravessar de forma eficiente a barreira hemato-encefálica, podendo assim acumular-se no sangue, facilitando a sua detecção. A LMP é também uma complicação da infecção VIH em fase terminal. Se a detecção de células CD4 e CD8 T específicas da JCV pode preceder a LMP associada à SIDA é um ponto de interesse que merece uma investigação mais aprofundada. No entanto, a LMP associada à SIDA é claramente diferente da LMP induzida pelo natalizumab., A maioria dos doentes infectados pelo VIH que desenvolvem LMP têm linfopenia CD4 profunda, que também altera a funcionalidade das células T CD8 devido à falta de Ajuda CD4 (25). Além disso, ao contrário dos doentes tratados com natalizumab, não existe bloqueio do tráfico de células T através da barreira hemato-encefálica, o que pode prevenir a acumulação de GDT específica no sangue.em conjunto, os nossos resultados sugerem que os ensaios funcionais capazes de detectar respostas GDT específicas podem ajudar a identificar doentes em risco de desenvolver LMP durante o tratamento com anticorpos que inibem o tráfico de linfócitos através da barreira hemato-encefálica.,