Abstract
Trichomonas vaginalis, um protozoário flagelado, é o agente causador da tricomonose, a doença sexualmente transmissível mais comum em todo o mundo. Tendo em conta o aumento da prevalência de isolados resistentes ao metronidazol, os medicamentos alternativos são essenciais para o sucesso do tratamento. Os produtos naturais são a fonte da maioria das drogas novas, e a sabedoria popular sobre o uso de plantas medicinais é uma ferramenta poderosa nesta busca., Neste estudo, a atividade de 10 plantas medicinais extensivamente utilizadas na vida diária pelo grupo indígena Mbyá-Guarani foi avaliada contra sete diferentes isolados de T. vaginalis. Entre os extratos aquosos testados, Verbena sp. (Guachu de ka’a, em Mbya-Guarani) e Campomanesia xanthocarpa (Guavira em Mbya-Guarani) mostrou a maior atividade contra o T. vaginalis com MICROFONE valor de 4,0 mg/mL, atingindo 100% de eficácia contra o parasita. Os testes de crescimento cinético mostraram que os extratos promoveram a abolição completa do crescimento após 4 h de incubação., Além disso, os extractos testados não promoveram uma actividade hemolítica significativa contra os eritrócitos humanos. Nossos resultados mostram pela primeira vez a atividade potencial da Verbena sp. and C. xanthocarpa against T. vaginalis. Além disso, este estudo demonstra que o conhecimento indígena é uma importante fonte de novos protótipos de agentes antiprotozoários.
1. Introdução Trichomonas vaginalis parasita o trato humano urogenital causando trichomonose, a doença sexualmente transmissível não viral mais prevalente em todo o mundo, sendo responsável por 248 milhões de novos casos anualmente ., Após a colonização, o parasita causa vaginite, uretrite e prostatite . Além disso , o agente patogénico tem sido associado a consequências graves como resultados adversos da gravidez e parto prematuro , infertilidade , predisposição para o cancro do colo do útero e doença inflamatória pélvica . Importante, a tricomonose atua como um cofactor na transmissão e aquisição do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Apesar do impacto desta infecção, o arsenal terapêutico está restringindo, e apenas metronidazol e tinidazol, ambos os medicamentos 5-nitroimidazol, são aprovados pela FDA para o tratamento da tricomonose ., Embora a taxa de cura seja elevada, a falência do tratamento pode ser observada e a resistência dos isolados de T. vaginalis é a principal razão da falência do tratamento . Neste sentido, é, sem dúvida, necessário que a investigação de novas alternativas para o tratamento de trichomonosis e duas estratégias podem ser seguidas: (i) a busca de novos alvos terapêuticos, o que é essencial para o desenvolvimento racional de novos agentes antiparasitários e (ii) a investigação de novos anti-T., compostos vaginalis estruturalmente distintos dos 5-nitroimidazóis e, consequentemente, agindo por mecanismos diferentes, como demonstrado pelo nosso grupo .neste contexto, os produtos naturais, especialmente plantas medicinais, são incomensuráveis como uma fonte potente de moléculas bioativas. Desde os tempos antigos, as pessoas usam plantas para tratar doenças infecciosas comuns, e alguns destes medicamentos tradicionais ainda estão integrados como parte da cura de diversas patologias . Além disso, a pesquisa baseada na informação etnofarmacológica resgata o imenso conhecimento empírico da utilização das plantas ., Neste contexto, em relação ao meio ambiente natural e à vasta riqueza de recursos genéticos, o Brasil é um país de grande interesse para a etnofarmacologia .os povos indígenas têm uma riqueza de informações sobre biodiversidade e sabem capturar e usar recursos naturais . Apesar do fato de que várias drogas foram descobertas através de curas tradicionais e conhecimento popular, no Brasil existem 122 grupos étnicos indígenas, mas apenas 30% deles foram investigados em relação aos aspectos etnobotânicos ., Portanto, o estudo das plantas utilizadas pela medicina indígena é importante para interligar a medicina tradicional e o ambiente biótico preservando o conhecimento antigo indígena.protozoários parasitários continuam a ser uma grande ameaça para a saúde humana e animal, e há poucos medicamentos eficazes para o tratamento de muitas doenças protozoárias. Tendo em conta a etnofarmacologia indígena como contribuinte para a triagem sistemática de plantas com atividade antiprotozoal, este estudo avaliou o anti-T., atividade vaginalis das plantas medicinais mais importantes utilizadas na medicina indígena Mbyá-Guarani, localizada no sul do Brasil.2. Materiais e métodos
2.1. Condições de cultura de parasitas
neste estudo, sete isolados de T., vaginalis foram utilizados: 30236 e 30238 da American Type Culture Collection (ATCC); TV-LACM1, TV a LACM2 e TV-LACM3 (fresco isolados clínicos de pacientes do sexo feminino); TV-LACH1 e TV-LACH2 (fresco isolados clínicos de pacientes do sexo masculino) todos do Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, UFRGS, Brasil (projeto com a aprovação ética pela UFRGS Comitê de Ética em Pesquisa, número 18923). As Trichomonads foram cultivadas axenicamente em meio de extracto de levedura-tripticase-maltose (TYM) (pH 6.0), complementadas com 10% de soro bovino inactivado pelo calor e incubadas a 37°C.
2, 2., Material vegetal
material Vegetal foi coletado a partir de tribo indígena Mbya-Guarani, localizado na Lomba do Pinheiro, Porto Alegre, RS, Brasil (30°06’47.62″ S e 51°07’37.85″ W), em Março de 2011. Esta aldeia é denominada Tekoá Anhetenguá( em inglês, verdadeira aldeia), e 200 pessoas vivem na área reunida em 40 famílias. As mulheres da aldeia têm o conhecimento de plantas medicinais usadas por toda a população e conduziu a coleta de espécimes. Foram recolhidas dez plantas habitualmente utilizadas na medicina indígena para doenças infecciosas: folhas de Aloe arborescens Mill., (ICN 173371), partes aéreas de Bidens pilosa L. (ICN 167397), partes aéreas de Rhipsalis baccifera (ICN 167402), cascas de Luehea divaricata (ICN 167403), raízes de Trichilia sp. (ICN 173126), leaves of Campomanesia xanthocarpa O. Berg. (ICN 167401), folhas de Coix lacryma-jobi Lin. (ICN 167396), folhas de Citrus limonium (ICN 167399), folhas de Citrus reticulata (ICN 173127), e folhas de Verbena sp. (ICN 167394). Os espécimes do voucher foram depositados no Herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN).
2, 3., Preparação de extractos vegetais
os extractos de plantas frescas foram preparados em conformidade com o uso tradicional dos povos indígenas por decocção a 60 ° C durante 60 minutos . Os extractos aquosos foram liofilizados e a solução de trabalho foi preparada com 8, 0 mg / mL em água de ultrapura, esterilizada por filtração (0, 22 µm) e armazenada a -20°C.
2, 4. Teste anti-Trichomonas vaginalis
10 extractos aquosos foram rastreados in vitro para detecção de actividade contra T. vaginalis. O ensaio foi realizado em 96 placas de microtitros com uma concentração final de 4, 0 mg/mL nos alvéolos., A concentração mínima inibitória (MIC) foi determinada usando um óctuplo diluição (4.0–0.031 mg/mL), e a viabilidade de trofozoítos foi determinado de acordo com um fluorimetric método . Foram realizados dois controlos: controlo negativo apenas com trofozoitos e controlo positivo com metronidazol de 8,0 µM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Os experimentos foram realizados pelo menos em três experimentos independentes, em triplicado. Os resultados foram expressos como a percentagem de trofozoitos viáveis em comparação com parasitas não tratados.
2, 5., Efeito de crescimento dos extractos aquosos
a fim de investigar o efeito dos extractos aquosos activos no crescimento de T. vaginalis, foi efectuada uma curva de crescimento cinético utilizando o isolado ATCC 30236. A densidade inicial dos parasitas de 2,0 × 105 trofozoitos/mL foi incubada com os extractos ao valor MIC no meio TYM. Os trofozoitos foram contados utilizando um hemocitómetro durante 72 H. os resultados foram expressos em número de trofozoite (105/mL)., Para a análise microscópica, os controles e tratados parasitas foram centrifugados por 10 minutos a 2.000 rpm para concentrar os organismos após 4 h de incubação, e a preparação foi observada em microscópio de luz (ampliada ×1000) de pelo trip corante azul de exclusão.
2, 6. Ensaio hemolítico
Este ensaio foi realizado de acordo com o método utilizado por Rocha et al. . O tipo sanguíneo o positivo de voluntários humanos saudáveis foi colhido com a solução de Alsever (1 : 1) e centrifugado a 2.000 rpm durante 5 minutos. A fracção eritrocitária foi lavada três vezes com PBS 1x (pH 7.,0) e ressuspendidos para dar suspensão a 1% de glóbulos vermelhos (v/v). As concentrações de extractos aquosos foram escolhidas de acordo com a concentração inibitória mínima (CMI) determinada no ensaio de susceptibilidade. Os eritrócitos foram incubados com os extractos a 37°C sob agitação durante 1 h E depois centrifugados a 3.000 rpm durante 5 minutos. A absorvância do sobrenadante foi medida a 540 nm. O experimento foi realizado em triplicado, e a porcentagem de hemólise causada por cada amostra testada foi calculada em comparação com 100% de atividade hemolítica da saponina de Quillaja saponaria .
3., Resultados e discussão
Este estudo avaliou a actividade anti-T. vaginalis dos extractos aquosos de 10 plantas medicinais utilizadas no sistema medicinal Mbyá-Guarani. Importante, entre as plantas testadas, encontramos dois extractos aquosos com uma potente actividade anti-T. vaginalis in vitro. Os extractos promissores são de Verbena sp. e Campomanesia xanthocarpa. O extracto de Verbena sp., com 4, 0 mg/mL, demonstrou a actividade óptima anti-T. vaginalis que induz a citotoxicidade completa (100% da morte de parasitas) em todos os isolados de trichomonads distintos [Figura 1 a)]., O extrato de folhas de Campomanesia xanthocarpa na mesma concentração também mostrou uma atividade muito alta anti-T. vaginalis, reduzindo a viabilidade do parasita até 96% [Figura 1(b)]. outros extractos aquosos apresentaram uma variedade de resultados. O extracto aquoso obtido de Bidens pilosa aboliu totalmente a viabilidade dos trofozoítas apenas do isolado 30236 [Figura 1 (c)]. O extracto dos barris de Luehea divaricata induziu uma redução da viabilidade de T. vaginalis de forma diferente em cada isolado de trichomonads testado [Figura 1 (d)]., As folhas de Coix lacryma-jobi induziram, em média, 75% da redução da viabilidade dos isolados de T. vaginalis; no entanto, para o isolado de TV-LACH2, a redução foi de apenas 40% [Figura 1 (e)]. Os isolados clínicos frescos de doentes do sexo masculino (TV-LACH1 e TV-LACH2) apresentaram maior susceptibilidade do que os isolados de doentes do sexo feminino (ATCC e fresh clinical) quando o extrato de raiz de Trichilia sp. foi ensaiado [Figura 1(f)]. Os extractos de folhas de Citrus limonium reduziram em cerca de 40% a viabilidade dos isolados [Figura 1 g)]., Os extratos de Aloe arborescens e Citrus reticulata diminuiu a viabilidade de 50% de pelo menos um isolate (Figuras 1(h) e 1(i)), enquanto Rhipsalis baccifera reduzido a apenas 30% a viabilidade de 30236 e TV-LACM2 isolados (Figura 1(j)).em comparação com os outros extractos, os extractos de Verbena sp. e C. xanthocarpa demonstrou a atividade mais promissora contra a T. vaginalis, e a concentração inibitória mínima foi determinada para o isolado 30236 (Tabela 1).,
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a fim de investigar o efeito do extracto mais activo no crescimento e viabilidade do parasita, foi efectuada uma curva de crescimento cinético. O controle exibiu o pico de crescimento clássico após 24 h de incubação; no entanto, os organismos tratados com extratos de Verbena sp. e C., xanthocarpa, após 4 h de incubação, evocou uma completa abolição do crescimento (Figura 2) e mostrou uma cor Azul Característica por exclusão do corante azul trípano indicando morte celular (Figura 3).
Cinética da curva de crescimento de Trichomonas vaginalis 30236 isolar após o tratamento com uma solução aquosa de extratos de Verbena sp. e Campomanesia xanthocarpa a 4, 0 mg / mL. O crescimento dos trofozoitos foi completamente inibido pelos extratos em 4 horas de incubação., Data represent means ± standard deviation of at least three experiments, all in triplicate.
(a) Control
(b) Verbena sp.
(c) Campomanesia xanthocarpa
(a) Control
(b) Verbena sp.,
(c), Campomanesia xanthocarpa
análise Microscópica dos parasitas morfologia em microscópio de luz (ampliada ×1000) de pelo trip corante azul de exclusão. a) controlo; B) após 4 horas de tratamento com extracto aquoso de Verbena sp.; c) após 4 horas de tratamento com extrato aquoso de Campomanesia xanthocarpa.
In order to investigate a possible effect of the C. xanthocarpa and Verbena sp., extractos na membrana dos parasitas e também para ter dados preliminares sobre a citotoxicidade contra as células de mamíferos, foi conduzida a actividade hemolítica destes extractos. A Verbena sp. e os extratos de C. xanthocarpa foram testados com valores de CMI e demonstraram lise de 6,5 e 7,6% de eritrócitos, respectivamente (Tabela 1). Estes resultados demonstraram que ambos os extractos, aos valores de CMI, não promoveram uma actividade hemolítica significativa, indicando que o mecanismo de Acção responsável pela redução da viabilidade do parasita provavelmente não envolve uma perturbação parasitária da membrana., Além disso, e o que é importante, estes resultados sugerem que ambos os extractos não são tóxicos para as células de mamíferos, uma vez que não lêem os eritrócitos humanos.este estudo contribui para resgatar os conhecimentos indígenas sobre plantas medicinais. Os indígenas Mbyá-Guarani usam Verbena sp. (Guachu ka’a in Mbyá-Guarani language), as tea, for relief of symptoms of infectious diseases, such as fever. Isto está de acordo com a literatura que relaciona Verbena sp. perfusão como sedativo, analgésico a doenças inflamatórias, queimaduras cutâneas, amenorreia, depressão e doenças gástricas ., Além disso, esta espécie tem uma variedade de constituintes químicos, como icariin, iridoid de esteviol, phenylpropanoid glicosídeo, esteróis, triterpenos, e glycoconjugate, e a atividade biológica pode ser parcialmente atribuída a eles . Além disso, esta tribo utiliza as folhas de C. xanthocarpa (Guavira na língua Mbyá-Guarani) para o tratamento de diarréia, dor de estômago e vermes., Esta planta é tradicionalmente usado no sul do Brasil como depurativo, antidiarrhoeic, limpador e antirheumatic, e para diminuir o colesterol no sangue , e essas propriedades podem ser atribuídas a taninos, saponinas e flavonóides (quercetina, myricetin, quercitrin, e no rutin), compostos presentes nas folhas de C. xanthocarpa .
A etnofarmacologia de resgate de usos históricos das plantas é reconhecida como valiosa para a bioprospecção, uma vez que eles oferecem a justificação para a seleção e pesquisa de plantas medicinais ., Este estudo descreve o primeiro relatório sobre a actividade antiprotozoária da Verbena sp. and C. xanthocarpa. Além disso, outras espécies das famílias Verbenaceae e Myrtaceae foram testadas contra T. vaginalis, no entanto, sem sucesso . Várias biodiversidades e conhecimentos tradicionais de diferentes populações guiaram estudos para a busca de novos protótipos anti-T. vaginalis. Recentemente, foi relatado o potencial das plantas tradicionalmente utilizadas da Caatinga contra a T. vaginalis . Calzada et al., demonstrou que as plantas usadas para distúrbios do tracto urogenital na medicina tradicional mexicana mostraram efeito contra este protozoário. As espécies de Amaryllidaceae usadas contra doenças venéreas na África do Sul também mostraram atividade promissora contra T. vaginalis . considerando o impacto da tricomonose na saúde pública e o número emergente de isolados resistentes de T. vaginalis, são necessárias alternativas para o tratamento desta infecção. Os produtos naturais são uma fonte promissora de moléculas ativas, e a abordagem etnofarmacológica resgata o conhecimento da população de plantas medicinais., Esta sabedoria combinada com estudos químicos e farmacológicos apresenta um valor precioso na bioprospecção de medicamentos inovadores, seguros e acessíveis. Este estudo pioneiro demonstrou resultados relevantes sobre a atividade anti-T. vaginalis da Verbena sp. and C. xanthocarpa, plants traditionally used by indigenous population Mbyá-Guarani for infectious diseases. Apesar de mostrar forte atividade anti-T. vaginalis, este relatório resgatou o conhecimento dos povos indígenas, evitando o aborto desta sabedoria.,
a contribuição dos autores
Clara Lia Costa Brandelli e Patrícia de Brum Vieira contribuíram igualmente para este trabalho.
agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa NANOBIOTEC-Brasil de CAPES e FAPERGS. Os autores agradecem ao chefe José Cirilo Pires Morinico (tribo Mbyá-Guarani), por tornar possível a realização deste estudo e pelas informações valiosas. Alexandre José Macedo e Tiana Tasca agradecem à CNPq as bolsas de pesquisa.
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