7.13 F: Sequenciamento de DNA com Base em Sanger Dideoxynucleotides

o sequenciamento Sanger, também conhecido como cadeia de terminação de seqüenciamento, refere-se a um método de sequenciamento de DNA desenvolvida por Frederick Sanger, em 1977. Este método baseia – se na amplificação do fragmento de ADN a sequenciar pela ADN polimerase e na incorporação de nucleótidos modificados-especificamente, dideoxinucleótidos (ddNTPs).,

o método clássico de terminação de cadeias requer um modelo de ADN de cadeia simples, um iniciador de ADN, uma polimerase de ADN, desoxinucleotidetrifosfatos normais (dNTPs) e nucleótidos modificados (dideoxintps) que terminam a elongação da cadeia de ADN. Estes nucleótidos de terminação em cadeia não possuem um grupo 3 ‘ – OH necessário para a formação de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos, fazendo com que a DNA polimerase cesse a extensão do DNA quando um ddNTP é incorporado. O ddNTPs pode ser rotulado radioativamente ou fluorescentemente para detecção em máquinas de sequenciação automatizada.,A amostra de ADN é dividida em quatro reacções sequenciadas separadas, contendo os quatro desoxinucleótidos padrão (dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e a ADN polimerase. A cada reação é adicionado apenas um dos quatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, ou ddTTP). Após rodadas de extensão de ADN-modelo a partir do iniciador ligado, os fragmentos de ADN resultantes são desnaturados pelo calor e separados por tamanho utilizando electroforese em gel. Isto é frequentemente realizado utilizando um gel de poliacrilamida-ureia desnaturante com cada uma das quatro reacções rodadas numa das quatro faixas individuais (faixas a, T, G, C)., As bandas de DNA podem então ser visualizadas por autoradiografia ou luz UV e a sequência de DNA pode ser lida diretamente do filme de raios X ou imagem gel.

variações técnicas da sequenciação da terminação da cadeia incluem marcação com nucleótidos contendo fósforo radioativo para marcação radioativa, ou usando um iniciador rotulado na extremidade 5′ com um corante fluorescente. A sequenciação de tinturas facilita a leitura em um sistema óptico para uma análise e automação mais rápidas e econômicas. The later development by Leroy Hood and coworkers of fluorescently labeled ddNTPs and primers set the stage for automated, high-through DNA sequencing. Os métodos de terminação de cadeia simplificaram muito a sequenciação do ADN., Mais recentemente, o sequenciamento do terminador de corantes foi desenvolvido. O sequenciamento do terminador de corantes utiliza a rotulagem do terminador de cadeia ddNTPs, que permite sequenciamento em uma única reação, ao invés de quatro reações como no método rotulado-primer. Na sequenciação do terminador de corantes, cada um dos quatro terminadores de cadeia de dideoxinucleótidos é rotulado com corantes fluorescentes, cada um dos quais emite luz em diferentes comprimentos de onda.,

instrumentos automatizados de sequenciação de ADN (sequenciadores de ADN) podem sequenciar até 384 amostras de ADN num único lote (executado) em até 24 ciclos por dia., Os sequenciadores de ADN realizam electroforese capilar para a separação de dimensões, detecção e registo da fluorescência dos corantes e saída de dados como cromatogramas de traço de pico fluorescentes. A automação levou à sequenciação de genomas inteiros.