의 완성이 인간 게놈 프로젝트에서는 2003 년에서 안내하는 새로운 시대의 급속한,저렴하고,정확한 게놈 분석—이라는 차세대 시퀀싱(NGS). NGS 는”1 세대 시퀀싱”기술을 기반으로 정확하고 비용 효율적인 시퀀싱 결과를 산출합니다.

Fred Sanger 는 최초의 전체 DNA 게놈 인 바이러스 파지를 시퀀싱 했습니까?X174,1977 년., 같은 해 Sanger 는 게놈 시대의 미래 백본 인 DNA 시퀀싱 기술을 개발했습니다. 그의 기술은 체인 종료 방법을 사용했습니다. 이것은 이제 게놈 시퀀싱의”1 세대 기술”으로 보입니다.

Sanger sequencing(또는 chain termination method)은 시퀀싱 기술의 1 세대이기 때문에이를 이해하는 것이 크게 중요합니다. 인간 게놈 프로젝트는 생거 시퀀싱 기술로 시작되었습니다.,

Sanger Sequencing Method

Sanger sequencing method 는 3’hydroxyl 그룹이 부족하고 대신 수소 원자를 갖는 deoxynucleoside triphosphates(dntps)의 일종 인 dideoxynucleotides(ddNTPs)에 의존합니다. 이러한 염기가 성장하는 DNA 서열에 결합하면 다른 염기를 결합 할 수 없으므로 복제를 종료합니다. Sanger 시퀀싱을 수행하기 위해 시퀀싱 할 유전 정보가 포함 된 솔루션에 프라이머를 추가 한 다음 솔루션을 4 개의 PCR 반응으로 나눕니다., 각 반응은 ddNTP(a,T,G 및 c ddNTP 그룹)로 치환 된 4 개의 뉴클레오티드 중 하나와 dNTP 믹스를 갖는 a 를 포함한다. PCR 의 끝에서,당신의 4 가지 반응 각각은 복제가 무작위로 종료되기 때문에 다양한 길이의 PCR 생성물을 산출 할 것입니다. 4 개의 레인이있는 젤에서 샘플을 실행함으로써 각 시퀀스가 동일한 원본 자료에서 복제 된 것처럼 시퀀스를 함께 조각 할 수 있습니다. 다음은 ddNTPs 가 굵게 표시되고 dNTPs 가 아닌 예입니다.

귀하의 시퀀스는 ATGCTCAG 입니다.,

의 반응을 줄

반응 ddATP:A,ATGCTCA,ATGCTCAG
반응 ddGTP:ATG,ATGCTCAG
반응 ddCTP:ATGC,ATGCTC,ATGCTCAG
반응 ddTTP:에서,ATGCT,ATGCTCAG

모든 반응에 한 번 실행 젤는 다음과 같이 보일 것이다(이미지 Olwen Reina):

각 밴드를 나타냅 길이가 다른 코드입니다. “ATGCTCA”

여전히 혼란?

파티 게임을 상상해 봅시다. 이 게임은 추측 게임이다., 다음은 재생되는 방법입니다.

당신은 숫자를 생각하고 그룹은 그것을 추측해야합니다. 까다로운 부분은 숫자가 길이가 200 자리라는 것입니다. 당신은 소리를 내지 않고 머리 속의 숫자의 자릿수를 읽고 있습니다. 모든 그래서 종종 사람을 중단,당신은 그들에게 한 자리를 생각하고 그것이 어디서의 순서는 200. 중단 될 때마다 다시 시작해야합니다. 당신은 몇 시간 후에 떠나고 그룹은 200 자리 숫자를 알아 내야합니다., 그들은 당신이 그들에게 준 정보를 함께 조각해야합니다,예를 들어 25 번째 숫자는 5 였고,40 번째 숫자는 0 이었습니다. 자신의 중단에서 정보를 사용하여,그들은 그들이 당신에게 준 번호를 반복 할 수 있습니다.

이것은 세계에서 가장 멍청한 게임처럼 들리지만 시퀀싱을 위해 매우 잘 작동합니다!

불행히도,그것은 느리고 비싸며(이전에는)방사성 물질에 의존합니다. 이것은 과학자들이 새롭고 더 나은 형태의 게놈 시퀀싱을 개발하도록 밀어 붙였습니다.,

차세대 시퀀싱 기술

가장 큰 진보에 게놈 서열이 증가하는 속도와 정확성,결과로 감소에서 인력과 비용이 있습니다. 속도는 병렬 분석과 높은 처리량 기술 덕분입니다. 그것은 사이의 차이점을 얻는 4 살을 읽 Moby Dick 및 단락하여 각각을 무리의 드라마 전공하고 요청을 읽는다.

시퀀싱 기계는 Sanger 가 자신의 방법을 개발 한 이후로 격렬하게 개선되었습니다., 1987 년 Applied Biosystems 는 AB370 이라는 자동 시퀀싱 기계를 처음으로 도입했습니다. 이 기계는 젤을 필요로하지 않고 생거의 사슬 종단 방법을 사용하는 모세관 전기 영동이라고하는 방법에 의존했습니다.

형광으로 라벨링된 사슬 종단 ddNTPs 를 PCR 반응 혼합물에 첨가한다. Sanger 시퀀싱 방법에 의해 다양한 길이의 PCR 제품이 생성 된 다음 크기에 따라 분리됩니다. 크기는 PCR 제품의 전반적인 음전하에 의해 측정됩니다. 음의 전하가 많을수록 조각이 길어집니다., DdNTP incorporation 의 위의 예를 들고 굵은 글자가 플루오로 크롬이 부착 된 ddNTPs 라고 상상해보십시오. 으로 조각을 뽑아 긍정적인 방향으로의 전극은 모세관(아래 이미지 참조),그들이 통과 레이저 빔을 유발하는 빛의 섬광에서 fluorochrome 에 부착된 ddNTP 는 특성의 기본 유형(예를 들면,녹색,노란색 T 블루,G,빨간색 C). 이 방법으로 게놈을 신중하게 읽습니다.

가장 큰 차이점은 기도의 비용., AB370 은 한 번에 96 염기,하루에 500K 염기를 감지 할 수 있었고 병렬 분석 및 높은 처리량 설정을 사용하여 600 염기의 판독 길이를 가졌습니다. 이러한 형태의 시퀀싱은 인간 게놈 프로젝트의 완성을위한 주요 도구가되었습니다.

NGS 는 1 세대 시퀀싱과 어떻게 비교됩니까?

NGS 는 향상된 정확성과 속도뿐만 아니라 인력과 비용 절감이 특징입니다. 게놈을 서열화하는 것만 큼 저렴하고 편리하거나 간단했던 시간은 결코 없었습니다., 틀림없이,가장 큰 개선은 시퀀싱 속도를 증가 병렬 분석의 개발이었다.

지금 우리를 늦추는 유일한 것은 결과의 해석입니다!이것이 도움이 되었는가? 그런 다음 네트워크와 공유하십시오.

Olwen Reina 작성