7.13F:Sangerジデオキシヌクレオチドに基づくDNAシーケンシング

鎖終端シーケンシングとしても知られているSangerシーケンシングは、1977年にFrederick Sangerによって開発されたDNAシーケンシングの方法を指す。 この方法は、ＤＮＡポリメラーゼによって配列決定されるＤＮＡ断片の増幅および修飾ヌクレオチド特異的にジデオキシヌクレオチド（ｄｄｎｔｐｓ）の取り込みに基づく。,

古典的な鎖終結法は、一本鎖DNAテンプレート、DNAプライマー、DNAポリメラーゼ、正常なデオキシヌクレオチド三リン酸（dntp）、およびDNA鎖伸長を終了させる修飾ヌクレオチド（dideoxyNTPs）を必要とする。 これらの鎖終端ヌクレオチドは、二つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成に必要な3′-OH基を欠いており、ddNTPが組み込まれるとDNAポリメラーゼがDNAの延長を止める原因となっている。 Ｄｄｎｔｐは、自動配列決定機における検出のために、放射性または蛍光標識されてもよい。,DNAサンプルは、標準的なデオキシヌクレオチド（dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）およびDNAポリメラーゼのすべてを含む四つの別々の配列決定の反応に分割されます。 各反応には、四つのジデオキシヌクレオチド（ｄｄａｔｐ、ｄｄｇｔｐ、ｄｄｃｔｐ、またはｄｄｔｔｐ）のうちの一つのみを添加する。 結合したプライマーからの鋳型DNA伸長のラウンドに続いて、得られたDNA断片を熱変性させ、ゲル電気泳動を用いてサイズによって分離する。 これは、変性ポリアクリルアミド-尿素ゲルを用いて頻繁に行われ、四つの反応のそれぞれが四つの個々のレーン（レーンA、T、G、C）のいずれかで実行される。, 次いで、ＤＮＡバンドは、オートラジオグラフィーまたはＵＶ光によって視覚化され得、ＤＮＡ配列は、Ｘ線フィルムまたはゲル画像から直接読み取ることができる。

鎖終端シーケンシングの技術的なバリエーションには、放射性リンを含むヌクレオチドによる放射性標識のためのタグ付け、または5’末端に蛍光色素で標識されたプライマーを使用することが含まれる。 染料-プライマー配列を読み光学システムのためのより速く、より経済的分析と自動化を実現しております。 Leroy Hoodと蛍光標識ddNTPsとプライマーの同僚による後の開発は、自動化されたハイスループットDNAシーケンシングの段階を設定しました。 鎖終結法は、DNA配列決定を大幅に簡素化しています。, 最近では、色素ターミネーターシーケンシングが開発されている。 色素ターミネーターシーケンシングは、標識プライマー法のように四つの反応ではなく、単一の反応でシーケンシングを可能にする鎖ターミネーターdntpsの標識を利用する。 色素ターミネーターシーケンシングでは、四つのジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーターのそれぞれが異なる波長で光を放出する蛍光色素で標識される。,

自動化されたDNAシーケンサー（DNAシーケンサー）は、単一のバッチ（実行）で最大384個のDNAサンプルを最大24回の実行でシーケンスすることができます。, ＤＮＡシーケンサは，サイズ分離，色素蛍光の検出と記録，蛍光ピークトレースクロマトグラムとしてのデータ出力のためのキャピラリー電気泳動を行う。 自動化はゲノム全体のシーケンシングにつながっています。