概要

目的。 サルコイドーシスは、病因が不明な全身性肉芽腫性疾患である。 多くの臨床症状が報告されており，急性疾患は亜急性および慢性疾患と区別する必要がある。 この疾患の予測不可能な臨床経過は、サルコイドーシスフォローアップにおけるバイオマーカー血清検出の臨床的有用性を評価するために私たちを促 メソッド。, キトトリオシダーゼ、ACE、KL-6、およびリゾチームの血清濃度は、定期的にシエナサルコイドーシス地域紹介センターで監視74サルコイドーシス患者（サンプリング時のステロイド療法で46）の人口とサルコイドーシス患者の臨床管理への貢献を比較することを目的としたコントロールのグループにおける異なる方法によって分析された。 結果。, KL-6濃度は、肺線維症を有するサルコイドーシス患者で有意に上昇し、DLcoおよびCPIスコアと有意に相関していたが、キトトリオシダーゼは肺外局在を有する患者で有意に高かった。 303.5IU/mlのカットオフ値では、KL-6は最高の感度（78％）を示し、キトトリオシダーゼはバイオマーカーの中で最高の特異性（85％）を報告した。 結論。 KL-6は、サルコイドーシス患者における線維性肺関与の信頼できるバイオマーカーである。, バイオマーカーの中で、KL-6は、慢性ステロイド療法の患者であっても、最高の感度と血清キトトリオシダーゼ最高の特異性を示し、肺外局在と相関するよう

1. はじめに

サルコイドーシスは、tリンパ球およびマクロファージの活性化および罹患した器官への移行に関連する全身性肉芽腫性疾患である。 抗原とAPC間の相互作用は、T細胞、マクロファージ、および類上皮および巨細胞からなるサルコイド肉芽腫の形成につながる、Tヘルパー1表現型（Th1）にTリンパ球を分極させる。, サルコイドーシスの経過は予測不可能である：寛解はほとんどの場合に起こり、持続性肉芽腫の炎症は線維性肺疾患につながる可能性がある。 したがって、臨床転帰を予測し、臨床決定を導くためには、感度と特異性が優れた特定のバイオマーカーが必要です。

ヒトキトトリオシダーゼは、活性化されたマクロファージおよび好中球によって分泌されるバイオマーカーである。 その生理学的役割は明らかではないが、キチンおよびキチン様基質の加水分解および分解において役割を果たす可能性がある。, 活性サルコイドーシス患者の血清およびBALにおいて、キトトリオシダーゼ濃度の増加が報告されている。 キトトリオシダーゼは放射線学的段階と相関を示した。 それは病気の臨床経過、ステロイドの敏感さおよび潜在的な再発を予測するかもしれません。 しかし，キトトリオシダーゼが肺外臓器関与を有するサルコイドーシス患者の管理において信頼できるかどうかは明らかではない。アンギオテンシン変換酵素（ACE）は、アンギオテンシンIをアンギオテンシンIIに変換する酸糖タンパク質である。, それは肺内皮細胞、主に活性化された肺胞マクロファージによって産生される。 それはサルコイドーシス患者の血清およびBALで上昇し、その濃度は放射線段階と相関する。 しかしながら、診断および予後ツールとしてのその有用性は、その低い感度および特異性によって制限される。 ACEは、特定の肉芽腫性障害（ベリリウム症および珪肺症を含む）、甲状腺機能亢進症、糖尿病および他の疾患において上昇する可能性がある。

リゾチームは単球-マクロファージ系によって産生され、肉芽腫の形成に関与する類上皮細胞はこの酵素を放出することができる。, サルコイドーシスの患者は手始めにリゾチームの高められた集中を示します。 リゾチームは、診断ツールではなく予後指標としてより多くみなされています。 それに結核および塵肺症のような肺疾患で高められる低い特定性があります。

Krebs von den Lungen-6（KL-6）は、AEC由来のヒト高分子量MUC1ムチンタンパク質である。 その血清濃度は、特発性肺線維症およびサルコイドーシスを含むいくつかのILDsで上昇する。, サルコイドーシスでは、KL-6はACE活性と相関する：それは主に陽性の肺蓄積のシンチグラフィー証拠を有するステージ2および3患者で増加する。 サルコイドーシスにおける血清KL-6の高レベルは、損傷または再生型2肺細胞に由来するKL-6の産生を反映する。

本研究では、慢性サルコイドーシス患者のコホートにおける異なるバイオマーカーの血清レベルを比較し、特定の表現型、臨床症状、および局所化との相関を

2. 材料および方法

2.1., 研究人口

我々は遡及的に74サルコイドーシス患者（27男性（36.5％）、年の平均年齢）を定期的にサルコイドーシスとILDsのためのシエナ地域紹介センターで監視 すべての患者は、国際ATS/ERS/WASOG基準に従って診断された。 すべてが診断から2年以上にわたって当センターでフォローアップを受けており、持続性の慢性疾患を示していました。 除外の基準はLofgrenシンドローム、激しい病気の手始め、自発の決断、または2年よりより少しのフォローアップの患者を含んでいました。,同日，肺機能検査（ＰＦＴ）および胸部Ｘ線を行い，スカディング基準に従った放射線病期分類を行った。 放射線学的分類は、広く受け入れられている基準に従って標準的な方法でサンプル検出にリンクされた：ステージ0、正常、ステージ1、実質介入のない両側肺門腺症、ステージ2、両側腺症および実質浸潤、ステージ3、実質浸潤、およびステージ4、サルコイドーシスに関連する肺線維症。, すべての患者は、肺線維症をチェックするために、胸部の高解像度CTスキャン（HRCT）を受けました。 すべての被験者は、地元の倫理委員会によって承認された研究にインフォームドコンセントを与えた。 私たちの人口における血清KL-6のカットオフ値を見つけるために、我々は25人の健康なボランティア（6人の男性、平均年齢）から血清サンプルを収集し、呼吸器疾患の病歴はなく、薬物を服用していない

2.2。, 肺機能テスト

次の肺機能測定は、温度と気圧の補正とイェーガーボディプレチスモグラフを使用して、ATS/ERS標準パラメータに従って行われました：第一秒（FEV1）、 全てのパラメータを予測値の百分率として表した。

2.3., 臨床表現型

患者は、サルコイドーシス文書（GenPhenReSa）だけでなく、複合生理学的指数（CPI）スコアにおける最近の遺伝子型-表現型の関係に従って、放射線肺の関与 すべての患者におけるCPIを、以前説明したように、以下の式に従って計算した：91-（予測DLCO）-（予測FVC）+。,

疾患の肺外局在を臓器特異的診断経路で評価した：肝臓、脾臓、骨、骨髄、胸腔外リンパ節、および皮膚の関与はすべて生検で証明され、心臓局在はMRイメージングで評価された。

2.4. キトトリオシダーゼアッセイ

キトトリオシダーゼ活性は、22μm4-メチルウンベリフェリルβ-D-N、N、N-トリアセチルキトトリオシダーゼ（Sigma Chemical Co.）クエン酸-リン酸緩衝液中で、pH5.2;100μl基質を1時間37℃でインキュベートし、反応を1.4ml0で停止した。,1Mグリシン-NaOHバッファー、pH10.8。 蛍光を450nmでPerkinElmer Victor X4蛍光計(励起波長365nm)で読み取った。 キトトリオシダーゼの血清活性はｎｍｏｌ／ｍｌ／ｈで表された。

2.5. ACEアッセイ

ACE活性は、血清中のACE活性の決定のために比色法（FAR srl、Verona、Italy）を用いて測定した。 ACE濃度の正常範囲は30-80IU/lであった。

2.6. リゾチームアッセイ
2.7。, Krebs von den Lungen-6アッセイ

血清KL-6は、NANOPIA（商標）KL-6試薬アッセイ（Sekisui Diagnostics、UK）によって測定した。 試金の原則は抗原抗体の反作用によってKL-6monoclonal抗体が付いているサンプルのsialylated炭水化物の抗原の膠着です。 吸光度の変化を測定して血清KL-6レベルを決定する。 KL-6濃度はIU/mlで表される。

2.8. 統計分析

データを以下のように表した。 群間の比較は、有意性をａｔに設定したＭａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ検定およびＫｒｕｓｋａｌ-Ｗａｌｌｉｓ検定によって行った。, スピアマン検定は変数間の相関を探すために使用されました。 統計解析とROC曲線はStatistica v7.0ソフトウェアを使用して行い、データのグラフィック表現はGraphPad Prism4.0ソフトウェアを使用して行った。

3. 結果

3.1. 臨床、放射線、および機能パラメータ

人口統計学的特徴、肺機能検査値、および人口のスカディング放射線段階は、表1に報告されている。 予想されるように、発症は主に第5十年（年）に起こり、決して喫煙者の女性に流行していました。, 病歴に関しては、46人の患者（62％、17人の男性）が血清サンプリング時にステロイド療法を受けており、プレドニゾンの平均投与量であった。 これらのうち、一つを除くすべてが一年以上の経口ステロイドを服用していました。 13人の患者（男性3人）は、経口ステロイド（メトトレキサート12人、アザチオプリン1人）と組み合わせて免疫抑制薬を服用していた。 中ステロイド-無料群(28患者10男性)で、患者さんった特定の治療のためのサルコイドーシス.,

私たちの集団では、PFTパラメータは肺容積の有意な変化なしで正常範囲にあった：63人の患者は、平均して軽度に障害されたDLCOの許容可能な操縦を行うことができた。

3.2. バイオマーカーの比較

血清KL-6濃度は、すべての患者および健康なボランティアで計算された;ACEおよびリゾチームは、すべての患者の血清中に検出され キトトリオシダーゼ活性を有する六つの患者<10nmol/ml/hは、CHIT1多型を有することが疑われ、分析から除外された。,

ステロイド治療患者とステロイドおよび免疫抑制療法で治療された患者との間にバイオマーカーレベルの有意差は認められなかった。

KL-6はACE（;）、リゾチーム（;）、およびキトトリオシダーゼ活性（;）と有意に相関していた（図1）。,


(a)

(b)

(c)


(a)
(b)
(c)

Figure 1
KL-6 correlations with ACE, chitotriosidase, and lysozyme. , ; , ; , .

3.3. Organ Involvement and Phenotypes

The percentage of sarcoidosis patients showing extrapulmonary involvement was 43.2%., 最も一般的な肺外局在は、皮膚（16患者、21.6％）、脾臓（11患者、14.8％）、および肝臓（5患者、6.7％）であった。 あまり一般的でない局所化は、眼（3患者、症例の4％）および胸腔外リンパ節（3患者、4％）;CNS（2患者の2.7％）および心臓、骨、または骨髄の関与（1.3％）であった。 肺外関与を有するサルコイドーシス患者は、限られた肺疾患（;）を有する患者よりも有意に高いキトトリオシダーゼ活性を有していた（図3）。 臓器局在化との関連では他の有意差は認められなかった。,

図3
肺外局在の有無にかかわらず、サルコイドーシス患者のキトトリオシダーゼ活性の比較。 . Ｇｅｎｐｈｅｎｒｅｓａ表現型に関連して，腹部病変（）を有する患者は，眼-心臓-皮膚-中枢神経系（ＯＣＣ）（），筋骨格-皮膚（）および単離された肺病変（）（それぞれ；）よりも有意に高いキトトリオシダーゼ活性を示した。, 統計的に有意な差は、これらのサブグループのKL-6、ACE、およびリゾチームレベルの間に発見されませんでした。

放射線スコアによると、線維性サルコイドーシス（ステージ4）の患者は、他の放射線病期（）と比較して血清KL-6の濃度が最も高かった（図4）。

図4
サルコイドーシス集団におけるRXステージ間のKL-6濃度の比較。 .

4., 議論

多くのバイオマーカーは、サルコイドーシスのために提案されているが、どれも治療または重要な臓器局在下での再発を識別するための満足のいく予 本研究では、異なるサルコイドーシスバイオマーカーを比較しました。 我々は、文献で報告されたサルコイドーシスの一般的な特徴と互換性のある臨床および人口統計データを持つ1年以上の治療における慢性疾患患者を選 このタンパク質はIPFで研究されており、サルコイドーシスにおけるその役割に関するデータはほとんどありませんが、KL-6をバイオマーカーのリストに含め, KL-6に対する私たちの関心は、重度の線維性肺の関与と貧しい生存との報告された相関に関連していた。 キトトリオシダーゼ，ＡＣＥおよびリゾチームは，ほとんどの患者がステロイドによる長期全身治療を受けており，血清試料採取時に活性疾患の徴候を示さなかったため，以前に観察されたよりも人口の有病率が低かった。 逆に、KL-6は303.5IU/mlのカットオフ値で、私たちの人口において良好な感度および特異性を示した。, 我々の知る限り、これは健康なコントロールのグループに対する慢性サルコイドーシスにおけるKL-6の特定のカットオフ値を調査する最初の研究である;しかし、これは研究の主な目的ではなかったし、データは患者のより広いコホートで検証する必要があります。 我々の知見は、すでに三好らによって報告されたILDサルコイドーシス患者における線維性肺関与および機能障害に対するKL-6の予測値を確認した。, しかし、我々の研究は、血清バイオマーカー、KL-6、およびCPI指数によって定量化されたサルコイドーシス患者における肺線維性肺関与との間に有意な相関を示 さらに、この知見は、これらの患者の臨床管理におけるサルコイドーシスの重症度を評価するためにKL-6測定の潜在的な有用性を維持し、DLCOパーセンテージとの有意な相関によってさらに確認される。, これらのデータは、特に線維性肺疾患を有する患者において、ステロイド療法に応答しない慢性マクロファージ活性化を示唆し、治療状態に関係なく一貫 KL-6発現の有意差は、KL-6が唯一の疾患の肺関与のために信頼できると考えることができることを示す、臨床表現型および/または肺外局在の間で ACE、リゾチーム、キトトリオシダーゼ、KL-6を含むサルコイドーシスのバイオマーカーの間で正の相関が検出されたため、予後指標のリストに含めることができます。,

一方、キトトリオシダーゼは、全身治療中の患者でもACE、リゾチーム、KL-6よりも敏感であることが判明し、最近のGenPhenReSa臨床表現型分類によると、胸腔外の関与を反映できる唯一のバイオマーカーであると考えられる。, 特に，その発現は，おそらく活性化された常在マクロファージによる過剰発現のために，腹部臓器局在（肝臓およびひ臓）を有する患者においてより顕著であり，このデータは，キトトリオシダーゼがサルコイドーシスにおける細網内皮系の活性化の信頼できるマーカーであることを示唆している。 ひ臓および肝臓のサルコイドーシスの局在化におけるキトトリオシダーゼ予後値に関する研究はなく、これは本研究の関連する新規性である。, KL-6とは異なり、キトトリオシダーゼ活性は、マクロファージ活性化の異なるパターンがサルコイドーシス患者の呼吸器系に存在し、バイオマーカーの発現に影響を与える可能性があることを示唆し、サルコイド肺関与または機能障害の重症度と相関していないようである。

結論として、慢性サルコイドーシス、重度の肺外関与、またはステージ4線維性障害を有する患者は、疾患の再発および全身治療に対する応答を予測するために信頼できる予後バイオマーカーの同定を必要とする重要なターゲットを表す。,

これらの予備的な結果に基づいて、キトトリオシダーゼおよびKL-6（およびACEまたはlsysozymeではない）の高レベルは、治療に関係なく、慢性サルコイドーシス患者 キトトリオシダーゼ活性は多臓器関与患者で有意に高く，多発性血管性サルコイドーシスの評価に有望な信頼性を示した。 逆に、kl-6レベルは線維性肺関与、CPIスコア、および減少DLCOパーセンテージと相関し、肺サルコイドーシスの重症度のマーカーとしての潜在的な役割を示唆してい, 興味深いことに、これらの知見は、この設定でもキトトリオシダーゼとKL-6の信頼性を拡大し、治療上のものを含む慢性多臓器サルコイドーシス患者の集団

データの可用性

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。 データはローラ-ベルガンティーニから入手できる（[email protected]）とエレナ-バルガリ（[email protected]）機密データへのアクセスの基準を満たす研究者のために。,

利益相反

著者は、利益相反がないことを宣言しています。

著者の貢献

Laura BergantiniとFrancesco Bianchiも同様に研究に貢献しました。

謝辞

本研究は、シエナ大学で行われました。